仝建業(yè)，閆洪超

(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇徐州221002;2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

WWOX基因是一種抑癌基因［1］。研究證實(shí)，WWOX基因突變或缺失與胰腺癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，通過(guò)改變WWOX基因的表達(dá)可以調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)［2～4］。Cyclin D1基因是細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，是一種癌基因。在G1期，當(dāng)Cyclin D1與細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDK4)結(jié)合后，可以激活后者的磷酸酶活性，使腫瘤抑制蛋白R(shí)b發(fā)生磷酸化，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。我們將外源性WWOX基因轉(zhuǎn)染到人卵巢癌干細(xì)胞中，研究其對(duì)Cyclin D1、CDK4蛋白的影響，探討治療卵巢癌的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌干細(xì)胞由本課題組篩選并保存［5］，pcDNA3.1-WWOX 真核表達(dá)載體由本課題組構(gòu)建并保存［6］，pcDNA3.1空質(zhì)粒由徐州醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心胡書群老師惠贈(zèng)，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、G418購(gòu)自 Invitrogen公司，WWOX、Cyclin D1和CDK4一抗及二抗均由Chemicon公司提供，碘化丙啶(PI)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌干細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染 按 LipofectamineTM2000說(shuō)明書將pcDNA3.1-WWOX及pcDNA3.1空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌干細(xì)胞，以600μg/mL新霉素衍生物G418維持篩選，挑選陽(yáng)性細(xì)胞克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)。分別將成功轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-WWOX和pcDNA3.1質(zhì)粒的干細(xì)胞組命名為 pcDNA3.1-WWOX重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組，以未轉(zhuǎn)染的卵巢癌干細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染組。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 WWOX蛋白表達(dá) 采用Western blot法。常規(guī)提取pcDNA3.1-WWOX重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組及對(duì)照組細(xì)胞總蛋白，參照BCA法說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度。以10%凝膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠泳(SDSPAGE)、轉(zhuǎn)膜、WWOX單克隆抗體結(jié)合，再用堿性磷酸酶結(jié)合的二抗結(jié)合，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色后照相，觀察各組細(xì)胞WWOX蛋白表達(dá)情況。

1.3.2 細(xì)胞周期分布 采用流式細(xì)胞儀分析。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的三組細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶消化，按3×105/孔細(xì)胞在6孔板上接種細(xì)胞，分別在細(xì)胞接種后48 h收集上述各組細(xì)胞，各約1×106個(gè)細(xì)胞，加入終濃度70%冷乙醇，4℃固定24 h，PBS洗滌離心三遍，加入Rnase A(1 mg/mL)于37℃水浴30 min，再加25 mg/mL的PI染色，4℃避光30 min，經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布情況，計(jì)算各組G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。

1.3.3 Cyclin D1及CDK4蛋白表達(dá) 采用Western blot法。常規(guī)提取pcDNA3.1-WWOX重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組及對(duì)照組細(xì)胞總蛋白，參照BCA法說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度。以10%凝膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、Cyclin D1及CDK4單克隆抗體結(jié)合，再用堿性磷酸酶結(jié)合的二抗結(jié)合，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色后照相，觀察各組細(xì)胞Cyclin D1及CDK4蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 WWOX蛋白表達(dá) 重組質(zhì)粒組WWOX蛋白呈高表達(dá)，而空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組未檢測(cè)到WWOX蛋白的表達(dá)，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞WWOX蛋白的表達(dá)

2.2 細(xì)胞周期分布 未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組G0/G1期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)分別為33.69% ±1.28%、33.87% ± 0.84%、64.47% ± 0.60%，重組質(zhì)粒組G0/G1期細(xì)胞百分比高于空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組S期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)分別為 58.47% ±0.71%、58.03% ±0.72%、27.52% ±0.60%，重組質(zhì)粒組 S期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)低于空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組G2/M期細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)分別為7.67% ±0.58%、8.0% ±0.00%、8.00% ±0.00%，重組質(zhì)粒組 G2/M 期細(xì)胞所占比例低于空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。

2.3 Cyclin D1及CDK4蛋白表達(dá) 未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平分別為1.601 ±0.028、1.607 ±0.045、1.068 ±0.057，重組質(zhì)粒組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平高于其他兩組(P＜0.05)。未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒組、重組質(zhì)粒組CDK4蛋白表達(dá)水平分別為 2.795 ±0.012、2.744 ±0.031、1.296±0.016，重組質(zhì)粒組 CDK4蛋白表達(dá)水平高于其他兩組(P ＜0.05)。

3 討論

WWOX基因約1 Mb大小，cDNA全長(zhǎng)2 264個(gè)堿基。WWOX基因在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，可能是一個(gè)廣譜的抑癌基因。研究表明WWOX基因在惡性腫瘤尤其是性激素依賴性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［7～9］。Gourley 等［10］研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中 WWOX mRNA的表達(dá)降低，提示W(wǎng)WOX基因能夠抑制卵巢腫瘤的發(fā)生。

Cyclin D1基因由295個(gè)氨基酸組成，分子量為34 kD，是細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種癌基因。在G1期，當(dāng)Cyclin D1與CDK4結(jié)合后，可以激活后者的磷酸酶活性，使腫瘤抑制蛋白R(shí)b發(fā)生磷酸化。高磷酸化的Rb蛋白因構(gòu)象改變而與轉(zhuǎn)錄因子E2F分離，E2F被釋放而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng)，促進(jìn)與DNA合成有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞周期。Brown等［11］認(rèn)為Cyclin D1表達(dá)可作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志，且表達(dá)量增加與卵巢癌的惡性行為與復(fù)發(fā)有關(guān)。

2000年，Weissman等［12］在干細(xì)胞的理論的基礎(chǔ)上首次提出"腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)"。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，腫瘤干細(xì)胞是一類能夠?qū)е履[瘤發(fā)生的具有自我更新能力的細(xì)胞，能夠進(jìn)行無(wú)限增殖和多向分化，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、異常增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥以及復(fù)發(fā)的根源［13］。Bapat等［14］通過(guò)對(duì)卵巢癌患者腹水中腫瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)了一些能懸浮生長(zhǎng)的球體細(xì)胞，這些球體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中具有極強(qiáng)的克隆能力，能夠自我更新，并且將這些球體細(xì)胞接種于裸鼠后能夠在裸鼠體內(nèi)自我更新并分化成相同性質(zhì)的腫瘤。證實(shí)卵巢癌中有卵巢腫瘤干細(xì)胞的存在，是卵巢癌治療的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。為進(jìn)一步深入研究卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，本課題組以人HO8910細(xì)胞(人卵巢低分化漿液性囊腺癌細(xì)胞株)為基礎(chǔ)，采用紫杉醇結(jié)合無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法，并通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)成功的篩選出具有陽(yáng)性表達(dá)特征的卵巢癌干細(xì)胞，并對(duì)其特異性標(biāo)記物及生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定［5］，為我們下一步的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本研究以pcDNA3.1-WWOX為表達(dá)載體，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，獲得穩(wěn)定高表達(dá)WWOX基因的卵巢癌干細(xì)胞重組質(zhì)粒組，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒組的Cyclin D1和CDK4表達(dá)明顯降低，提示W(wǎng)WOX基因參與了Cyclin D1、CDK4的代謝，且重組質(zhì)粒組細(xì)胞被顯著抑制在G0/G1期，其機(jī)制可能與WWOX基因下調(diào)Cyclin D1、CDK4的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，WWOX基因是與人卵巢癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的一種抑癌基因，將其導(dǎo)入到人卵巢癌干細(xì)胞系中可明顯抑制卵巢癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，為卵巢癌的基因治療提供了依據(jù)。

［1］Bednarek AK，Laflin KJ，Daniel RL，et al.WWOX，a novel WW Domain-containing protein mapping to human chromosome16q23.3-24.1，a region frequently affected in breast cancer［J］.Cancer Res，2000，60(5):2140-2145.

［2］Kuroki T，Yendamuri S，Trapasso F.The tumor suppressor gene WWOX at FRA16D is involved in pancreatic carcinogenesis［J］.Clin Cancer Res，2004，10(7):2459-2464.

［3］Nunez MI，Ludes-Meyers J，Abba MC，et al.Frequent loss of WWOX expression in breast cancer:correlation with estrogen receptor status［J］.Breast Cancer Res Treat，2005，89(02):99-105.

［4］Donati V，F(xiàn)ontanini G，Dell-Omodarme M.WWOX expression in different histologic types and subtypes of non-small cell lung cancer［J］.Clin Can Res，2007，13(3):884-899.

［5］閆洪超，于楠，仝建業(yè)等.人卵巢癌HO8910細(xì)胞株中干細(xì)胞的篩選及生物學(xué)特性鑒定［J］，江蘇醫(yī)藥，2012，38(10):362-365.

［6］閆洪超，陸曉媛，韓秋峪等.WWOX基因真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定［J］.江蘇醫(yī)藥，2008，34(3):287-292.

［7］Chang NS，Schultz L，Hsu LJ，et al.17β-Estradiol up regulates and activatesWOX1/WWOXv1 and WOX2/WWOXv2 in vitro:potential role in cancerous progression of breast and prostate to a premetastatic state in vivo［J］.Oncogene，2005，24(4):714-723.

［8］Aqeilan RI，Trapasso F，Hussain S，et al.Targeted deletion of WWOX reveals a tumor suppressor fuction［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(10):3949-3954.

［9］Paige AJ，Taylor KJ，Taylor C，et al.WWOX:a candidate tumor suppressor gene involved in multiple tumor types［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(20):11417-11422.

［10］Gourley C，Paige AJ，Taylor KJ，et al.WWOXmRNA expresstion profile in epithelial ovarian cancer surports the role ofWWOX variant1 as a tumour suppressor although the role of variant4 remains unclear［J］.Int JOncol，2005，26(6):1681-1689.

［11］Brown LA，Irving J，Parker R，et al.Amplification of EMSY，a novel oncogene on 11q13，in high grade ovarian surface epithelial carcinomas［J］.Gynecolo Oncol，2006，100(2):264.

［12］Weissman IL.Stem cells:units of development，units of regenration，and units in evolution［J］.Cell，2000，100(1):157-168.

［13］王敏，王銀龍.腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18(1):59-61.

［14］Bapat SA，Mali AM，Koppikar CB，et al.Stem and progenitor-like ceils contribute to the aggressive behavior of human epithelialovarian cancer［J］.Grocer Res，2005，65(8):3025-3029.