高登 肖輝

結(jié)核桿菌PCR對肺外結(jié)核的早期診斷價(jià)值

高登 肖輝

目的 探討結(jié)核桿菌聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在肺外結(jié)核病中早期診斷的臨床意義。方法 收集134例標(biāo)本, 分別用抗酸染色法、培養(yǎng)法、PCR法對結(jié)核桿菌進(jìn)行檢測比較。結(jié)果 抗酸染色法與PCR法比較陽性率分別為23.4%、53.2%；培養(yǎng)法與PCR法比較陽性率分別為28.3%、47.8%, 兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PCR法陽性率比抗酸染色法、培養(yǎng)法分別高出了29.8%、19.5%；并且抗酸染色法和培養(yǎng)法陽性的標(biāo)本PCR法100%陽性, 對照組PCR法100%陰性。結(jié)論 PCR法對結(jié)核桿菌的檢測具有高特異、高敏感、快速、簡便等特點(diǎn), 在肺外結(jié)核的早期診斷中具有很好的診斷參考價(jià)值。

結(jié)核桿菌聚合酶鏈反應(yīng)；肺外結(jié)核；早期；快速；診斷價(jià)值

肺外結(jié)核是指結(jié)核桿菌感染肺部以外的組織、器官等引起的結(jié)核病。常見的如結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性胸(腹)膜炎、淋巴結(jié)核、腎結(jié)核、骨結(jié)核等。肺結(jié)核的診斷通過流行病學(xué)、影像學(xué)、痰檢等方法診斷已經(jīng)很成熟［1］。肺外結(jié)核由于發(fā)病范圍廣、檢測所需標(biāo)本如腦脊液、胸腹水等獲取相對困難、特殊, 與肺結(jié)核相比有其特殊性。因而在肺外結(jié)核中應(yīng)用結(jié)核桿菌PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)能夠準(zhǔn)確、快速的進(jìn)行診斷?，F(xiàn)就本院2009年1月～2014年3月結(jié)核桿菌PCR檢測的134例標(biāo)本的檢測, 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 134例結(jié)核桿菌PCR檢測均為本院的住院患者。其中男83例, 年齡3～78歲, 平均年齡36.3歲；女51例, 年齡5～82歲, 平均年齡30.4歲。134例患者中, 77例被臨床確診為肺外結(jié)核, 為實(shí)驗(yàn)組；57例確診為非肺外結(jié)核,為對照組。

1.2 標(biāo)本 134例標(biāo)本中有胸腹水81例, 腦脊液24例, 尿液13例, 血液8例, 穿刺液8例。以上標(biāo)本均由護(hù)士采集于加蓋的滅菌容器中(血液標(biāo)本用EDTA-K2抗凝血)立即送檢。1.3 儀器及方法

1.3.1 PCR法 儀器用ABI GeneAmp 5700型基因擴(kuò)增儀,試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)。操作和陰陽性判斷均按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.2 抗酸染色法 用萋尼氏抗酸染色法做濃集涂片染色,按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程, 以-～++++報(bào)告結(jié)果。

1.3.3 結(jié)核桿菌培養(yǎng)法 標(biāo)本離心取沉淀物接種到改良羅氏培養(yǎng)基斜面上, 置37℃培養(yǎng)8周。有不透明淡黃色、粗糙、干燥、凸起于培養(yǎng)基或成菜花樣菌落生長并做抗酸染色。符合以上條件者為培養(yǎng)陽性, 否則陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

肺外結(jié)核77例中, PCR法陽性41例, 陽性率53.2% (41/77)；抗酸染色法陽性18例, 陽性率23.4%(18/77), 并且18例抗酸染色陽性標(biāo)本PCR呈陽性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理, 兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在送檢標(biāo)本中, 有46例做結(jié)核桿菌培養(yǎng), 陽性13例, 陽性率28.3%(13/46), 在培養(yǎng)的46例標(biāo)本中PCR法陽性22例, 陽性率47.8%(22/46), 并且13例培養(yǎng)陽性標(biāo)本PCR法全部陽性。兩法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PCR法陽性結(jié)果數(shù)值5.88×102～3.29×105copy/ml。涂片陽性在±～+++之間。在對照組非肺外結(jié)核的57例中, PCR法、抗酸染色法及培養(yǎng)法均為陰性。見表1, 表2。

表1 PCR法與抗酸染色法陽性率比較［n (%)］

表2 PCR法與培養(yǎng)法陽性率比較［n (%)］

3 討論

肺外結(jié)核在身體除毛發(fā)、指甲外多器官組織都可發(fā)病,感染途徑、表現(xiàn)癥狀不盡相同, 診斷方法、檢測手段也各有不同。多數(shù)患者的病情都被其他病癥所掩蓋。因而早期診斷顯得尤其重要。通常所用的檢查方法中, 結(jié)核菌素試驗(yàn), 其陽性僅表示受結(jié)核桿菌感染, 并不一定發(fā)病?？顾崛旧芷渌种U菌等的影響, 準(zhǔn)確度、靈敏度都受到一定程度的限制。本次實(shí)驗(yàn)陽性率僅23.4%。大量的病例僅憑這種方法會(huì)漏檢。培養(yǎng)法雖然對結(jié)核病的診斷比較可靠, 但結(jié)核桿菌生長緩慢, 通常需要2～4周才有菌落生長。另外, 有些病例經(jīng)抗癆藥物治療后, 結(jié)核桿菌受抑制, 需要6～8周甚至20周才出現(xiàn)菌落。更甚者由于抗癆藥物的影響導(dǎo)致細(xì)胞壁缺陷而使培養(yǎng)失敗。也就是說, 培養(yǎng)法準(zhǔn)確度、靈敏度雖可取, 本次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)法陽性率28.3%, 但重要的一點(diǎn)是：培養(yǎng)法由于耗時(shí)長, 對臨床的早期診斷和治療基本上是沒有意義的。而PCR法是在特定的反應(yīng)體系中通過樣本中結(jié)核桿菌DNA, 對其進(jìn)行體外快速、高保真的復(fù)制增殖, 使標(biāo)本中極微量的結(jié)核桿菌DNA被迅速放大到巨大的信號而被檢測到, 具有高特異性、高靈敏度、快速簡便等特點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果其拷貝數(shù)5.88×102～3.29×105copy/ml足以說明這一點(diǎn)。其陽性率與抗酸染色法、培養(yǎng)法比較, 分別高出了29.8%、19.5%。并且抗酸染色法和培養(yǎng)法陽性的標(biāo)本在PCR法中100%陽性。突顯了PCR法的高準(zhǔn)確度和高靈敏度。此特點(diǎn)已有報(bào)道［2,3］。PCR法在定性分析中, 因?qū)U(kuò)增產(chǎn)物要進(jìn)行瓊脂電泳, 存在PCR污染問題?？梢蛭廴径霈F(xiàn)假陽性。但本次實(shí)驗(yàn)是定量分析, 整個(gè)反應(yīng)體系是邊擴(kuò)增邊檢測, 反應(yīng)體系是一個(gè)密閉的反應(yīng)體系。很少存在污染而呈現(xiàn)假陽性。因而在57例非肺外結(jié)核病例中, PCR法均為陰性。這也從另一方面說明了PCR法的高特異性和高靈敏性。

綜上所述, PCR法檢測結(jié)核桿菌, 其靈敏度和準(zhǔn)確度明顯高于其他檢測方法。具有高特異、高敏感、快速、簡便等特點(diǎn), 在肺外結(jié)核的早期診斷和治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值,應(yīng)成為一種成熟的常規(guī)方法而大力推廣。使其在結(jié)核病的診治中發(fā)揮重要的作用。

［1］ 金建東.熒光定量PCR檢測痰結(jié)核桿菌 DNA 及其臨床應(yīng)用.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 31(22):3565-3566.

［2］ 羅振元, 黃盛文, 吳嫻,等.1624例不同類型樣本結(jié)核桿菌DNA檢測結(jié)果分析.醫(yī)學(xué)信息(上旬刊), 2010, 23(9):3376-3378.

［3］ 丁娟娟, 陳卓昌.熒光定量PCR檢測胸腔積液中結(jié)核分支桿菌DNA的臨床研究.山東醫(yī)藥, 2012, 52(20):71-72.

2014-07-16］

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