高軼 付圣靈 江文洋 李斌峰 田義濤 付向?qū)?/p>

肺癌是全球癌癥相關死亡的首要原因[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%。盡管肺癌已形成以手術治療為主的綜合治療模式，但肺癌的5年生存率仍然不高，其中手術切除的pIII期NSCLC患者五年生存率只有9%-24%[2]。因此，迫切需要尋找新的肺癌生物標志物，指導肺癌的個體化治療，提高患者的預后。MiRNA是一類長19 nt-25 nt的小非編碼單鏈RNA，其通過對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)揮生物學功能。MiRNA對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移各個環(huán)節(jié)都有調(diào)控作用[3]。例如，miR-21通過抑制PTEN的表達，促進非小細胞肺癌的生長、轉(zhuǎn)移、放化療耐藥，其高表達不利于患者的預后[4,5]。MiR-155已被報道在許多類型的腫瘤中表達上調(diào)，其對腫瘤細胞的生物學行為有廣泛的調(diào)控作用?，F(xiàn)有的研究[6-9]表明miR-155高表達不利于急性髓系白血病、乳腺癌、胰腺癌、腎透明細胞癌患者的預后，但其與NSCLC患者預后的關系仍不明確。本研究擬通過檢測162例pIII期NSCLC福爾馬林固定石蠟包埋組織（formalinfixed, paraffin-embedded, FFPE）中miR-155的表達水平，并結(jié)合臨床資料分析其與預后的關系，探討其作為NSCLC預后標志物的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料和試劑 收集華中科技大學附屬同濟醫(yī)院胸外科2006年10月-2012年9月手術切除、臨床資料完整、尚有石蠟標本的pIII期原發(fā)NSCLC 162例。162例患者均經(jīng)切片、HE染色，明確病理診斷（2003年WHO肺腫瘤組織學分類標準）。所有患者術前均未化療或放療。腫瘤分期根據(jù)2009年UICC肺癌TNM分期。患者年齡22歲-78歲，中位年齡55歲；男性133例，女性29例，pIIIa期131例，pIIIb期31例。隨訪時間為1個月-72個月，中位隨訪時間14.5個月。生存期的計算從手術日期起到隨訪日期或由于復發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。miRNeasy FFPE Kit購自德國QIAGEN公司，RT-PCR試劑盒購自北京Trans-Gen公司，SYBR green PCR master mix購于大連TAKARA公司，miR-155及U6逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR引物購自廣州銳博公司。

1.2 方法

1.2.1 FFPE組織含miRNA總RNA的提取 每例蠟塊標本切10 μm厚切片，去除接觸空氣的第1張切片，取4張切片用于總RNA提取。使用miRNeasy FFPE Kit石蠟包埋組織中的總RNA，按試劑說明書操作。使用Beckman Coulter DU700分光光度計測量OD260/OD280。

1.2.2 qRT-PCR檢測 取總RNA 2 μg進行cDNA第一鏈合成，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成模板。qRT-PCR采用SYBR green PCR mix體系，條件為95oC 1 min變性，95oC 15 s，60oC 20 s，70oC 15 s，40個循環(huán)，以U6為上樣內(nèi)參照，相對基因定量用ΔCT（ΔCTmiR-155-CTU6）方法計算。ΔCT值越大，表示miR-155表達量越低。將162例患者按miR-155相對表達量分為兩組，ΔCT小于ΔCT平均值為miR-155高表達組，ΔCT大于ΔCT平均值為miR-155低表達組。

1.3 統(tǒng)計分析 SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學處理分析。采用卡方檢驗進行高表達和低表達miR-155組間臨床資料的差異分析；采用Spearman等級相關分析進行miR-155相對表達量和臨床病理資料相關性分析；應用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，采用對數(shù)秩檢驗（Log-rank檢驗）；Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 石蠟包埋組織提取RNA及miR-155的檢測 所有標本提取的RNA（包含miRNA）OD260/OD280值均在1.806-1.983之間。qRT-PCR反應的溶解曲線和擴增曲線見圖1A。

2.2 miR-155在pIII期NSCLC中的表達 miR-155在162例pIII期NSCLC中均有表達。以U6為內(nèi)參照，相對表達量ΔCT在0.01-8.21之間，平均值3.66±2.01（圖1B）。

2.3 miR-155組間臨床資料差異分析 將162例患者按miR-155相對表達量分為兩組，ΔCT小于3.66為miR-155高表達組（n=94），ΔCT大于3.66為miR-155低表達組（n=68）。統(tǒng)計學結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度在miR-155高表達和低表達組間具有統(tǒng)計學差異（P=0.032），而年齡、性別、吸煙指數(shù)、腫瘤組織類型、TNM分期在兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義（表1）。 Spearman等級相關分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度與miR-155表達成正相關（r=0.169,P=0.032）（表1）。

2.5 miR-155的表達與預后的關系

2.5.1 Kaplan-Meier法單因素生存分析 對臨床病理特征和miR-155的相對表達量進行Kaplan-Meier法單因素生存分析，結(jié)果顯示：患者的性別（χ2=6.982, P=0.008）、病理組織類型 (χ2=5.206, P=0.023）、TNM分期（χ2=10.730,P=0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度（χ2=17.003, P＜0.001）、miR-155的表達（χ2=16.007, P＜0.001）是影響手術切除的pIII期NSCLC患者總體生存的重要預后因素，而年齡、PS評分、手術方式、術后是否進行放化療與預后無關（表2）。 miR-155低表達組總體生存率高于高表達組，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=16.007, P＜0.001）（圖2）。我們根據(jù)組織類型、淋巴結(jié)狀態(tài)、術后輔助治療進行亞組分析（表3）。在鱗癌亞組（χ2=9.634, P=0.002）和腺癌亞組（χ2=9.087, P=0.003）中，miR-155高表達組的總體生存率均低于miR-155低表達組 。根據(jù)淋巴結(jié)狀態(tài)將162例患者分成N0-1和N2兩個亞組。 統(tǒng)計學分析顯示，在N0-1的亞組中，miR-155的表達對總體生存率無明顯的影響（χ2=0.993, P=0.319）。而在N2亞組中，miR-155高表達組的總體生存率低于miR-155低表達組，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=13.773, P＜0.001）。在接受術后輔助治療亞組（χ2=13.659, P＜0.001）和未接受術后輔助治療亞組（χ2=4.499, P=0.034）中，miR-155高表達均不利于患者的預后。而且，低表達miR-155但未接受術后輔助治療患者的總體生存率高于miR-155高表達但接受術后輔助治療的患者（χ2=4.716, P=0.030）。

2.5.2 Cox比例風險回歸模型分析 Kaplan-Meier單因素分析發(fā)現(xiàn)，性別、病理組織類型、TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、miR-155表達水平均與患者的總體生存率相關，故均納入Cox多因素分析模型。采用條件向前法，結(jié)果顯示：性別（RR=2.274, 95%CI: 1.353-3.823, P=0.002）、腫瘤T分期（RR=1.227, 95%CI: 1.033-1.458, P=0.020）、淋巴結(jié)狀態(tài)（RR=3.552, 95%CI: 2.044-6.173, P＜0.001）、miR-155的表達水平（RR=2.311, 95%CI: 1.479-3.611, P＜0.001）是影響手術切除的III期NSCLC患者預后的獨立危險因素（表4）。

圖1 qRT-PCR檢測miR-155和內(nèi)參U6的表達Fig 1 miR-155 and internal reference U6 were detected by qRT-PCR

圖2 miR-155高表達組和低表達組的Kaplan-Meier累計生存時間曲線分析（χ2=16.007, P＜0.001）Fig 2 Kaplan-Meier survival curves according to miR-155 expression in total patients (χ2=16.007, P＜0.001)

表1 miR-155表達與手術切除的pIII期NSCLC的臨床病理特征聯(lián)系Tab 1 Correlation of miR-155 expression with clinicopathologic characteristics of resected stage III NSCLC

3 討論

TNM分期是目前評價肺癌術后生存的重要指標，但由于不同個體之間腫瘤的異質(zhì)性，同一分期的不同患者預后仍不完全相同[2]。因此，需要尋找新的腫瘤生物標志物，指導個體化治療，提高患者的預后。MiRNA因其廣泛參與腫瘤起始和進展的調(diào)控引起了學者的關注。根據(jù)患者腫瘤組織和血液中miRNA的表達量作為腫瘤診斷和預后的標志物是可行和有效的[3,10]。MiRNA檢測最佳的標本材料是新鮮冰凍組織，但臨床研究中新鮮冰凍組織難以大批量獲取。石蠟包埋組織樣本較新鮮冰凍組織容易獲取和保存，但也存在mRNA降解的問題。miRNA單鏈長度只有19個-25個堿基，在標本固定過程中降解較少，并且較mRNA對化學和RNA酶誘導的降解穩(wěn)定。已有研究[11]證明FFPE中miRNA的檢測結(jié)果與新鮮冰凍組織相似。因此，F(xiàn)FPE是進行miRNA標本檢測的理想材料[12,13]。

MiR-155由人類21號染色體上的BIC基因編碼，其表達受腫瘤抑制因子BRCA1負性調(diào)控。BRCA1通過與組蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2, HDAC2）形成復合物使miR-155啟動子去乙?；种苖iR-155的表達[14]。研究[15]表明miR-155在許多腫瘤組織中高表達，而且有超過100個靶基因被證明受其調(diào)控，涉及JAK/STAT、TLR、ERK/MAPK、B細胞信號受體等多個關鍵信號通路。MiR-155異常高表達可以促進腫瘤細胞的生存、增殖、遷徙、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成[7,15]。MiR-15在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的多重作用提示其可以作為腫瘤治療靶點和預后因子。已有研究[6-9]證明miR-155表達升高是急性髓系白血病、乳腺癌、胰腺癌、腎透明細胞癌預后不良的危險因素。目前關于miR-155與NSCLC患者預后的關系尚存在爭議。我們對162例pIII期NSCLC手術患者的研究顯示，miR-155高表達對預后有不利影響，而且miR-155的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度正相關。

表2 不同預后因素對手術切除的pIII期NSCLC患者生存的影響Tab 2 Influence of different prognostic factors on MST of resected stage III NSCLC patients

Yanaihara等[5]使用液相雜交和qRT-PCR對104例NSCLC的miRNA表達譜進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-155高表達與肺腺癌預后負相關。Raponi等[16]使用qRT-PCR對61例肺鱗癌手術患者標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-155是肺鱗癌預后的不利因素。本研究通過qRT-PCR法檢測162例pIII期非小細胞肺癌患者FFPE樣本中miR-155的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-155高表達是pIII期NSCLC患者預后不良的獨立危險因素。在肺鱗癌亞組和肺腺癌亞組中，miR-155與預后負相關，這與Yanaihara等[5]和Raponi等[16]研究基本一致。Donnem等[17]使用原位雜交檢測335例I期-IIIa期NSCLC miR-155的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-155高表達只在肺腺癌和淋巴結(jié)陰性肺鱗癌患者中顯示出不利于預后的趨勢，但差異未達到統(tǒng)計學意義，在肺鱗癌淋巴結(jié)陽性的患者反而對預后有利。我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-155與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度正相關，這與Chen等[18]在乳腺癌中的研究結(jié)果一致。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度是影響患者預后的重要因素，本研究的結(jié)果顯示不同miR-155表達水平組間淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度存在差異。因此，我們根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度進行分層分析。在N0和N1的pIII期NSCLC患者中，miR-155高表達對患者預后無明顯影響。而在N2的患者中，miR-155高表達不利于患者的預后，差異有統(tǒng)計學意義。這提示miR-155可能在肺癌的遷徙轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其表達的上調(diào)引起腫瘤轉(zhuǎn)移能力增強，繼而對患者預后產(chǎn)生不利影響。多因素生存分析顯示miR-155高表達是影響pIII期NSCLC患者預后的獨立危險因素。Donnem等[17]的研究中，肺鱗癌淋巴結(jié)陽性的患者總數(shù)僅有60例，樣本數(shù)較少。本研究針對162例pIII期NSCLC手術患者，其中鱗癌患者105例，不同患者之間腫瘤分期差異更小。

表3 miR-155的表達對預后影響的亞組分析Tab 3 Prognostic impact of miR-155 expression in the histological and nodal status and adjuvant therapy subgroups

表4 影響手術切除的pIII期NSCLC患者生存時間的Cox比例風險回歸模型分析Tab 4 Multivariate Cox proportional hazard analyses of prognostic factors for overall survival rates of resected stage III NSCLC patients

我們還根據(jù)術后輔助治療情況進行分層分析。在術后輔助治療和未接受術后輔助治療亞組中，miR-155高表達組的總體生存率均低于miR-155低表達組。而且，miR-155低表達的患者即使術后未行輔助治療，其總體生存率仍優(yōu)于接受術后輔助治療的高表達miR-155的患者。這進一步提示了miR-155對肺癌患者預后的重要影響。本研究不足之處：術后輔助治療資料不夠詳細，缺少疾病無進展生存期。

綜上所述，miR-155高表達是手術切除的pIII期NSCLC患者預后的不利因素，miR-155高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度正相關。通過檢測NSCLC患者手術切除標本中的miR-155的表達可以更好的判斷肺癌的惡性程度和預后，指導腫瘤患者的個體化治療。我們設想，通過靶向特定miRNA的寡核苷酸藥物等技術抑制miR-155的表達[19]，抑制miR-155的生物學作用，改善肺癌患者的預后。