郭紅娟 朱光發(fā) 吳春婷

每年肺癌的全球發(fā)病率超過(guò)150萬(wàn)例，中國(guó)的發(fā)病率尤其高；在中國(guó)的大多數(shù)城市，肺癌的發(fā)病率在各種癌癥發(fā)病率中居首位；隨著工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境污染的持續(xù)存在，據(jù)估計(jì)，肺癌的發(fā)病率和死亡率仍會(huì)持續(xù)上升[1]。核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系；NF-κB通過(guò)與不同細(xì)胞因子的相互作用參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲等過(guò)程。通過(guò)對(duì)IKK激活、IκBα降解、IκBα核遷移及NF-κB與DNA結(jié)合等過(guò)程的抑制可直接抑制NF-κB的活化，從而不僅參與對(duì)細(xì)胞增殖、血管發(fā)生、腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，亦可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[2]。近年來(lái)，有關(guān)動(dòng)物模型和細(xì)胞培養(yǎng)的研究已經(jīng)確定了NF-κB和肺癌發(fā)生之間的聯(lián)系，并且強(qiáng)調(diào)了針對(duì)NF-κB信號(hào)通路對(duì)肺癌進(jìn)行治療和化學(xué)預(yù)防的意義[3]。NF-κB蛋白家族有p65（RelA）、RelB、c-Rel、p50/p105（NF-κB 1）和p52/p100（NF-κB 2）五個(gè)亞基，RelA（p65）是NF-κB活化途徑的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，不僅參與細(xì)胞增殖及抗細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，而且在組織浸潤(rùn)、遷移、轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學(xué)行為中也發(fā)揮一定的作用[4,5]。本研究利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建人NF-κBp65 短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA, shRNA）慢病毒載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒，感染A549細(xì)胞并篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株，檢測(cè)對(duì)NF-κBp65的干擾效果、對(duì)抑制性κBα（inhibitor-κBα, IκBα）表達(dá)水平的影響及對(duì)A549細(xì)胞遷移、粘附能力的影響，進(jìn)一步研究NF-κBp65和IκBα的關(guān)系及兩者對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討NF-κBp65、IκBα在癌癥預(yù)防和治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 pLVX-shRNA-tdTomato-puro（紅色熒光）慢病毒干擾載體質(zhì)粒及慢病毒包裝細(xì)胞293T細(xì)胞（深圳百恩維生物公司）；肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞（購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心）；大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），DNA Marker（北京全式金生物公司），限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、BamHI、XhoI和T4 DNA連接酶（美國(guó)NEB公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶和Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司），高效轉(zhuǎn)染試劑盒（深圳百恩維生物公司提供），AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），SYBR Green（Takara公司）。鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體、鼠抗人IκBα單克隆抗體及鼠抗人GAPDH一抗（美國(guó)Cell Signal公司），24孔transwell小室（孔徑8 μm）（Corning Costar公司）。

1.2 方法

1.2.1 人NF-κBp65 shRNA慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank中人NF-κBp65基因序列[6]，從invitrogen公司合成shRNA片段，其中在5'端引入一個(gè)BamHI位點(diǎn)，3'端引入一個(gè)XhoI位點(diǎn)和一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，所設(shè)計(jì)亂序?qū)φ招蛄校╯cramble）和干擾序列（shRNA）見(jiàn)表1。pLVX-shRNA-tdTomato-Puro載體質(zhì)粒由限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和EcoRI酶進(jìn)行雙酶切后，分別與NF-κBp65 scramble和NF-κBp65 shRNA通過(guò)T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切電泳及基因測(cè)序。

表1 基因序列Tab 1 Gene sequences

1.2.2 慢病毒包裝及病毒滴度測(cè)定 在10 cm培養(yǎng)皿接種（6-8）×106293T細(xì)胞，37 °C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞密度達(dá)70%-80%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h-4 h更換培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS培養(yǎng)基；按慢病毒包裝試劑盒說(shuō)明配制轉(zhuǎn)染液，混勻后室溫靜置30 min，逐滴均勻加入培養(yǎng)皿中，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h-16 h后改換為新鮮培養(yǎng)基，分別于24 h和48 h后收集上清；兩次上清混合后1,000 rpm離心5 min，0.45 μm PVDF濾器過(guò)濾至50 mL離心管中，4 °C，50,000 g高速離心2 h，棄上清，PBS重懸病毒沉淀，室溫靜置2 h，用移液器輕輕地吹勻，室溫靜置30 min，分裝，-80 °C冰箱保存。

慢病毒滴度測(cè)定方法：于測(cè)定前一天取48孔板，按3×104/孔接種HEK293細(xì)胞，并在完全培養(yǎng)基中[DMEM+10%FBS+青/鏈霉素（P/S）]加入多聚季丁胺，使其終濃度為8 μg/mL；用上述培養(yǎng)基10倍梯度稀釋病毒，然后分別吸取10 μL病毒稀釋液到相對(duì)應(yīng)的48孔板中，37 °C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，16 h-24 h后換液；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3 A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選 在6孔板中按6×105/孔接種A549細(xì)胞，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；次日，換為含有8 μg/mL多聚季丁胺的完全培養(yǎng)基并以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）=10加入病毒；第3日換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后消化并傳代；待細(xì)胞貼壁后按5 μg/mL的濃度加入嘌呤霉素做篩選，并每2 d-3 d換液進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選；一星期后換為含濃度為2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基；等細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后消化、擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4 干擾效果的鑒定

1.2.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量-PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR） 將A549細(xì)胞、A549/NF-κB p65 scramble和A549/NF-κB p65 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株分別接種在6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后加Trizol提取細(xì)胞總RNA，純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)genbank中人NF-κBp65基因的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，以人GAPDH基因作為內(nèi)參；NF-κBp65 cDNA引物序列：上游5'-CCCCACGAGCTTGTAGGAAAG-3'，下游5'-CCAGGTTCTGGAAACTGTGGAT-3'，擴(kuò)增片段為128 bp；GAPDH cDNA引物序列：上游5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'，下游5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'，擴(kuò)增片段為66 bp，均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 °C 5 min，進(jìn)入45次循環(huán)（95 °C 45 sec，60 °C 1 min采集熒光），最后55 °C 5 min（繪制溶解曲線）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL體系，反應(yīng)條件：50 °C 2 min，95 °C 10 min，95 °C 30 s，60°C 30 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.4.2 Western blot 將A549細(xì)胞、A549/NF-κB p65 scramble和A549/NF-κB p65 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株分別接種在6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后加0.25%胰酶200 μL消化細(xì)胞，置于1.5 mL離心管中，離心棄上清后加入50 μL RIPA組織裂解液置于冰上，反復(fù)震蕩、充分裂解，離心取上清。BCA法測(cè)蛋白濃度，將各組織樣品濃度調(diào)至相同，保證每個(gè)電泳孔道加入60 μg蛋白混合樣品，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶（TBST溶解）封閉，室溫孵育60 min；加入1:1,000稀釋?zhuān)?% BSA-PBS 稀釋?zhuān)┑腘F-κBp65、IκBα一抗，1:800稀釋的GAPDH 4 °C過(guò)夜；次日PBS洗10 min×3次，加入1:3,000稀釋的抗NF-κBp65、抗IκBα熒光二抗及1:5,000稀釋的抗GAPDH熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS洗10 min×3次。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色拍照。以同一泳道中NF-κBp65和GAPDH條帶灰度值之比反映NF-κBp65蛋白表達(dá)水平，IκBα和GAPDH條帶灰度值之比反映IκBα蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞遷移、粘附能力的鑒定

1.2.5.1 細(xì)胞遷移-transwell 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，饑餓培養(yǎng)過(guò)夜，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加至24孔transwell小室的上室，下室預(yù)先加入600 μL含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；取出小室，多聚甲醛固定10 min；PBS洗2遍，DAPI染核，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.2.5.2 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)——MTT法 取10 mg/mL BSA和10 mg/L纖維粘連蛋白按50 μL/孔加入96孔板中，4 °C過(guò)夜，BSA為對(duì)照基底；次日吸出多余液體，每孔加入50 μL含10 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 °C靜置30 min；0.25%胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，各取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，1 h后棄上清，PBS清洗2次-3次。溴化-3（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四唑［3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT］法測(cè)定各孔吸光度（optical density, OD）值，以BSA組貼壁細(xì)胞OD值為參照，計(jì)算細(xì)胞粘附率。

粘附率計(jì)算公式：粘附率=[（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值/對(duì)照組細(xì)胞OD值）-1]×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用Mean±SD表示，多組樣本間的比較采用單因素方差分析，如果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較用q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人NF-κBp65 shRNA慢病毒載體構(gòu)建結(jié)果 將具有氨芐抗性的陽(yáng)性克隆菌株小量快速提取質(zhì)粒，分別用XhoI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)2,065 bp的條帶（圖1）。對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行命名，分別命名為NF-κBp65 scramble病毒載體和NF-κBp65 shRNA病毒載體挑取酶切鑒定正確的菌液去測(cè)序，測(cè)序引物為U6-F：5'-TACGATACAAGGCTG-TTAGAGAG-3'，由深圳百恩維生物公司完成測(cè)序，其結(jié)果顯示：NF-κBp65 scramble和NF-κBp65 shRNA的測(cè)序結(jié)果均與設(shè)計(jì)序列一致。證實(shí)NF-κBp65 scramble和NF-κBp65 shRNA慢病毒載體構(gòu)建成功（圖2）。

2.2 慢病毒包裝結(jié)果 pLVX-shRNA-tdTomato-Puro載體質(zhì)粒帶有紅色熒光，NF-κBp65 scramble慢病毒載體和NF-κBp65 shRNA慢病毒載體經(jīng)293T細(xì)胞包裝后可在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)紅色熒光的293T細(xì)胞（圖3）。

2.3 A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選和鑒定結(jié)果 經(jīng)過(guò)數(shù)日篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞對(duì)比觀察（圖4）。

2.4 NF-κBp65干擾效果的鑒定結(jié)果

2.4.1 qRT-PCR結(jié)果 A549細(xì)胞與A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞間的NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平（1.03±0.18 vs 0.97±0.10）無(wú)明顯差異（P=0.802,3），A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞的NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平（0.25±0.07）明顯低于A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞（P＜0.05, P＜0.01），與A549細(xì)胞相比NF-κBp65 mRNA的表達(dá)水平下降75.3%（圖5）。

圖1 NF-κBp65 shRNA慢病毒載體和NF-κBp65 scramble慢病毒載體酶切鑒定結(jié)果Fig 1 Identified results of NF-κBp65 shRNA lentiviral vector and NF-κBp65 scramble lentiviral vector

圖2 亂序?qū)φ招蛄泻透蓴_序列測(cè)序結(jié)果（部分）。A: NF-κBp65 scramble測(cè)序結(jié)果；B: NF-κBp65 shRNA測(cè)序結(jié)果。Fig 2 Sequencing results of scramble control sequences and interference sequences (partly). A: sequencing result of scramble control sequences; B:sequencing result of interference sequences.

2.4.2 Western blot結(jié)果 A549細(xì)胞與A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞間NF-κBp65蛋白表達(dá)水平（0.57±0.07 vs 0.49±0.04,P=0.394,9）無(wú)明顯差異，A549/NF-κBp65 shRNA 細(xì)胞的NF-κBp65蛋白表達(dá)水平（0.24±0.03）明顯低于A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞（P＜0.05, P＜0.01），與A549細(xì)胞相比NF-κBp65蛋白表達(dá)水平下降52.8%；A549細(xì)胞與A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞間IκBα蛋白表達(dá)水平（0.43±0.04 vs 0.36±0.01, P=0.201,5）無(wú)明顯差異，A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞的IκBα蛋白表達(dá)水平（0.22±0.02）明顯低于A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞（P均＜0.01）（圖6）。

2.5 細(xì)胞遷移能力鑒定結(jié)果 A549細(xì)胞與A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞相比細(xì)胞遷移數(shù)無(wú)明顯差異（290.4±14.7 vs 278.6±18.0, P=0.6258），A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞的遷移數(shù)（118.2±13.9）明顯少于A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞（P均＜0.01）（圖7A-圖7D）。

2.6 細(xì)胞粘附率鑒定結(jié)果 A549細(xì)胞、A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞、A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞粘附率的均值分別為39.4%、33.8%、16.2%。A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞粘附率[（39.4±2.2）% vs（33.8±4.5）%]無(wú)明顯差異（P=0.304,8）；A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞的粘附率（16.3±2.1）%明顯低于A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞（P＜0.01, P＜0.05）（圖7E）。

3 討論

圖4 篩選出的A549/NF-κBp65 scramble穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和A549/NF-κBp65 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。a、b和c為自然光下A549細(xì)胞；d、e和f為紅色熒光下A549細(xì)胞（bar=50 μm）。Fig 4 Stably transfected cell strains of A549/NF-κBp65 scramble and stably transfected cell strains of A549/NF-κBp65 shRNA that have been screened out. a, b and c are A549 cells under white light; d, e and f are A549 cells under red fluorescence (bar=50 μm).

圖5 不同A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中NF-κBp65的mRNA表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染NF-κBp65 shRNA后的A549細(xì)胞NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染NF-κBp65 scramble后的A549細(xì)胞均明顯降低；轉(zhuǎn)染NF-κBp65 scramble后的A549細(xì)胞NF-κBp65 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組A549細(xì)胞無(wú)明顯差異。a：A549細(xì)胞；b：A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞；c：A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞。NS：P＞0.05；*P＜0.05；**P＜0.01。Fig 5 Expression levels of NF-κBp65 mRNA in different stably transfected A549 cell strains Expression level of NF-κBp65 mRNA was significantly reduced in A549/NF-κBp65 shRNA cells than that in A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells, but no difference between A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells. a: A549 cell; b:A549/NF-κBp65 scramble cell; c: A549/NF-κBp65 shRNA cell; NS: P＞0.05; *P＜0.05;**P＜0.01.

圖6 不同A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中NF-κBp65蛋白和IκBα蛋白表達(dá)水平。A: A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞及對(duì)照組A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞中NF-κBp65蛋白和IκBα蛋白的western blot結(jié)果，以GAPDH蛋白為內(nèi)參；B: 轉(zhuǎn)染NF-κBp65 shRNA后的A549細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染NF-κBp65 scramble后的A549細(xì)胞均明顯降低；轉(zhuǎn)染NF-κBp65 scramble后的A549細(xì)胞NF-κBp65蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組A549細(xì)胞無(wú)明顯差異；C: 轉(zhuǎn)染NF-κBp65 shRNA后的A549細(xì)胞IκBα蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染NF-κBp65 scramble后的A549細(xì)胞均明顯降低；轉(zhuǎn)染NF-κBp65 scramble后的A549細(xì)胞IκBα蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組A549細(xì)胞無(wú)明顯差異。a：A549細(xì)胞；b：A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞；c：A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞。NS：P＞0.05；*P＜0.05；**P＜0.01。Fig 6 Expression levels of NF-κBp65 protein and IκBα protein in different stably transfected A549 cell strains. A: The western blot results of NF-κBp65 protein and IκBα protein in A549/NF-κBp65 shRNA cells, A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells. GAPDH served as an internal control; B: Expression level of NF-κBp65 protein was significantly reduced in A549/NF-κBp65 shRNA cells than that in A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells, but no difference between A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells; C: Expression level of IκBα protein was significantly reduced in A549/NF-κBp65 shRNA cells than that in A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells, but no difference between A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells. a: A549 cell; b: A549/NF-κBp65 scramble cell; c: A549/NF-κBp65 shRNA cell. NS: P＞0.05; *P＜0.05; **P＜0.01.

NF-κB通過(guò)介導(dǎo)過(guò)度炎癥反應(yīng)，引起肺部反復(fù)的損傷和修復(fù)，細(xì)胞更新增快，基因突變累積，最終導(dǎo)致肺癌的發(fā)生[7]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證明NF-κB是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要促進(jìn)因子。NF-κB可誘導(dǎo)參與細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、分化、增殖等不同過(guò)程的200多個(gè)基因的表達(dá)[3]。通過(guò)參與細(xì)胞遷移和粘附過(guò)程，NF-κB可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5]。

作為NF-κB蛋白家族的主要成員，Rel（p65）基因異常擴(kuò)增或上游調(diào)節(jié)因子的異?；罨梢餘F-κB活化失調(diào)，促進(jìn)自身免疫性疾病、慢性炎癥及癌癥的發(fā)生[8]。IκB蛋白的表達(dá)是NF-κB活化的最敏感標(biāo)志之一，通過(guò)檢測(cè)IκBα磷酸化和降解可明確NF-κB是否發(fā)生活化，IκBα作為NF-κB的抑制物，其表達(dá)水平在NF-κB活化過(guò)程恢復(fù)后下調(diào)[4,9]。對(duì)已活化的NF-κB有多種機(jī)制可使其表達(dá)水平下調(diào)，包括新合成的IκBα在內(nèi)的特征性反饋環(huán)路；其中IκBα主要是通過(guò)與DNA“競(jìng)爭(zhēng)性”結(jié)合核NF-κB，進(jìn)而使NF-κB與DNA解離后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[9]。

有研究顯示，直接抑制NF-κB相關(guān)基因或間接干擾其相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子均可發(fā)揮與轉(zhuǎn)錄抑制因子相同的功能，即介導(dǎo)NF-κB的活化。直接抑制包括作用NF-κB活化途徑的不同成分或過(guò)程，例如IKK的激活，IκBα的降解，核轉(zhuǎn)位及NF-κB與DNA綁定，其中IKK被認(rèn)為是最有效的選擇性藥物靶點(diǎn)；間接抑制是指抑制可激活NF-κB活化途徑的蛋白但并非是組成成分[3]。Kasperczyk等[10]的研究表明，IκBα的超級(jí)抑制物或p65基因敲除可特異性抑制NF-κB活化；Chen等[4]的研究表明：通過(guò)siRNA途徑敲除IKKβ或RelA比超級(jí)抑制物IκBα能更好的阻斷A549細(xì)胞中NF-κB的活化。

圖7 不同A549穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株間細(xì)胞遷移數(shù)、粘附率的比較。A、B、C: 分別為A549細(xì)胞、A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞和A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞經(jīng)transwell板上小孔發(fā)生遷移細(xì)胞的代表性視野（200×, bar=100 μm）；D: A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞的遷移能力明顯低于A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞；E: A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞的粘附率明顯低于A549細(xì)胞和A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞。a：A549細(xì)胞；b：A549/NF-κBp65 scramble細(xì)胞；c：A549/NF-κBp65 shRNA細(xì)胞。NS：P＞0.05；*P＜0.05；**P＜0.01。Fig 7 Comparisons about numbers of migrated cells and adhesion ratio among different stably transfected A549 cell strains. A, B and C showed representative fields of cells migrated through filters in transwell inserts from A549, A549/NF-κBp65 scramble and A549/NF-κBp65 shRNA cells respectively (200×, bar=100 μm); D: The ability of migration was significantly reduced in A549/NF-κBp65 shRNA cells than that in A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells, but no difference between A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells; E: The adhesion ratio of A549/NF-κBp65 shRNA cells was significantly reduced than that in A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells, but no difference between A549 cells and A549/NF-κBp65 scramble cells. a: A549 cell; b: A549/NF-κBp65 scramble cell; c: A549/NF-κBp65 shRNA cell. NS: P＞0.05; *P＜0.05; **P＜0.01.

RNA干擾是一個(gè)高特異、高選擇抑制目標(biāo)基因表達(dá)的自然過(guò)程，在癌癥的個(gè)體化治療方面有重要價(jià)值，已被廣泛應(yīng)用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤基因治療等領(lǐng)域[11,12]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NF-κBp65受抑制后，其抑制因子IκBα的蛋白水平較空白對(duì)照組A549細(xì)胞和亂序?qū)φ战MA549細(xì)胞均明顯下調(diào)；靜息狀態(tài)下，p65/p50異源二聚體與IκBα在細(xì)胞質(zhì)中以聚合物形式存在，大多數(shù)刺激因子通過(guò)IKK介導(dǎo)IκBα N-末端絲氨酸殘基的磷酸化激活NF-κB[13]。這可能是因?yàn)楦蓴_NF-κBp65基因后A549細(xì)胞中NF-κBp65蛋白水平下降，此時(shí)“多余”的IκBα無(wú)法與NF-κBp65/p50結(jié)合，發(fā)生了降解，較未受干擾的A549細(xì)胞中的IκBα表達(dá)量降低。

NF-κBp65基因被干擾后的A549細(xì)胞遷移能力及粘附率較空白對(duì)照組A549細(xì)胞和亂序?qū)φ战MA549細(xì)胞均明顯降低。NF-κB通過(guò)對(duì)MMPs、血管細(xì)胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）、胞間粘附因子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）、趨化因子受體CXCR4和絲氨酸蛋白酶尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑（serine protease urokinase-type plasminogen activator, uPA）等的調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞遷移和粘附過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3,5]。抑制NF-κB活性可下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，肺癌的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力受抑[14]。本研究中NF-κBp65活性受抑，A549細(xì)胞遷移、粘附能力均下降，表明這可能是NF-κBp65活性受抑造成MMPs、VCAM-1、ICAM- 1等的表達(dá)下調(diào)的效應(yīng)。

綜上所述，NF-κBp65活性受抑可間接影響其抑制因子IκBα蛋白水平，慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)可有效的用于以NF-κB為靶點(diǎn)的腫瘤的基因治療中，通過(guò)抑制NF-κB活化，明顯降低腫瘤細(xì)胞的遷移、粘附能力，為腫瘤基因治療中將NF-κB作為腫瘤治療或預(yù)防的靶點(diǎn)提供了有利的證據(jù)。