李紫璇 曲連悅 鐘紅珊 徐克 邱雪杉

據(jù)《2012年中國腫瘤登記年報》顯示：肺癌居全國惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率第一位。目前，手術(shù)治療仍是治療肺癌最為行之有效的方法。然而，很多患者在確診時已經(jīng)發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移失去了手術(shù)的機(jī)會。因此，研究腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制對肺癌的防治有重要意義。腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，也是判定腫瘤分期，估計患者預(yù)后的重要因素。因此，近年來對于淋巴管特異性標(biāo)記物及其調(diào)控機(jī)理的研究逐漸深入，抗腫瘤淋巴管的形成也成為抗腫瘤治療的新方向。已經(jīng)證實，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）-C的表達(dá)和淋巴管生成密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)VEGF-C能特異性的誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖和淋巴管的形成[1]。VEGF-C是VEGF家族的成員，它可與VEGFR-2和VEGFR-3結(jié)合，分別調(diào)控血管和淋巴管的生成。

胸腺素是一類分子量5 kDa左右的小分子多肽，最初從小牛胸腺中提取，按等電點(diǎn)不同分為三個家族 （α、β和γ）[2]。其中胸腺素β10（thymosin β10, Tβ10）是哺乳動物體內(nèi)含量最為豐富的β族胸腺素之一，研究[3-5]證實Tβ10能影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。但目前，Tβ10在腫瘤中的作用存在很大爭議。有研究[4]發(fā)現(xiàn)Tβ10在甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中高表達(dá)，同時能夠促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，但也有研究[6]證明Tβ10在卵巢癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，Tβ10過表達(dá)可以抑制腫瘤的生長并促進(jìn)腫瘤的凋亡。然而目前Tβ10在不同腫瘤中所發(fā)揮的作用及其機(jī)制仍未有定論。

我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Tβ10在肺癌中表達(dá)上調(diào)，并與肺癌的分期、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后有關(guān)[3]。這些結(jié)果初步證實了Tβ10在肺癌發(fā)生發(fā)展中所起的促進(jìn)作用。在本實驗中我們課題組將在肺癌細(xì)胞系中研究Tβ10對淋巴管標(biāo)記物VEGF-C的調(diào)控作用，并探討其中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人肺癌細(xì)胞系SPC-A-1和A549細(xì)胞購自ATCC，LK2購自日本癌癥研究中心細(xì)胞資源庫。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco，胎牛血清購自碧云天。RNA提取購自Invitrogen，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒及PCR引物合成購自TaKaRa。P-AKT（Ser473）（D9E）單克隆抗體購自CST；AKT、VEGF-C抗體購自Santa Cruz；β-actin抗體購自武漢博士德，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG購自中杉金橋。BCA法蛋白定量試劑盒購自碧云天，裂解液及超敏發(fā)光試劑盒購自Pierce。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SPC-A-1、A549和LK2細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基含10%的滅活小牛血清。37oC、5%CO2的條件下培養(yǎng)，每兩天換一次液，并用0.25%的胰酶進(jìn)行傳代。實驗前取對數(shù)生長的細(xì)胞，饑餓4 h后根據(jù)文獻(xiàn)報道和預(yù)實驗結(jié)果（文中未給出）加入100 ng/mL Tβ10，按時間點(diǎn)收集細(xì)胞，每次實驗同一個處理因素設(shè)兩個復(fù)孔，重復(fù)三次實驗。

1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR） RT-PCR提取細(xì)胞總RNA按RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)結(jié)束后再取2 μL的RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，VEGF-C引物F：5'-TTC CAT TAT TAG ACG TTC CCT G -3'，R：5'-GTG TTT TCA TCA AAT TCT CGG T-3'，片段長度：305 bp，退火溫度為54oC；β-actin引物F：5'-AAA TCG TGC GTG ACA TTAA-3'，R：5'-CTC GTC ATA CTC CTG CTT G-3'，片段長度：513 bp，退火溫度為55oC。

1.4 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并加入裂解液冰浴中裂解，低溫高速離心（4oC, 12,000 rpm, 30 min），提取上清為總蛋白。上清蛋白量為60 μg。12%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)?。?0 V, 120 min）到PVDF上。5%BSA室溫封閉2 h。一抗分別用P-AKT（1:1,000）、AKT（1:300）、VEGF-C（1:500）和β-actin（1:500），4 °C孵育過夜。分別與對應(yīng)的二抗（1:2,000）室溫孵育2 h，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集。進(jìn)行灰度測定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，兩組之間用t檢驗進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有意義。

2 結(jié)果

2.1 Tβ10促進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞中VEGF-C mRNA表達(dá) 取對數(shù)生長的SPC-A-1細(xì)胞接種于六孔板中，待其貼壁后在實驗組加入濃度為100 ng/mL的人重組Tβ10，對照組加入同體積的PBS。分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8h、24 h收集細(xì)胞檢測各組VEGF-C mRNA的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入Tβ10后細(xì)胞內(nèi)VEGF-C mRNA含量逐漸上升（圖1）。

2.2 在SPC-A-1細(xì)胞中Tβ10能夠促進(jìn)P-AKT及VEGF-C蛋白表達(dá) 在SPC-A-1細(xì)胞中加入Tβ10后分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h收集細(xì)胞，提取總蛋白后檢測不同組細(xì)胞P-AKT、AKT及VEGF-C蛋白變化。我們發(fā)現(xiàn)加入濃度為100 ng/mL的Tβ10后P-AKT及VEGF-C蛋白水平隨時間的延長逐漸升高（P＜0.05），但是總的AKT水平未見明顯變化（圖2）。這些結(jié)果說明在SPC-A-1細(xì)胞中Tβ10可能是通過促進(jìn)AKT磷酸化激活促進(jìn)VEGF-C表達(dá)的。

圖1 SPC-A-1細(xì)胞系中加入100 ng/mL人重組Tβ10后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h，用RT-PCR的方法檢測細(xì)胞內(nèi)VEGF-C mRNA變化，柱圖顯示加入Tβ10后SPC-A-1細(xì)胞中VEGF-C mRNA水平隨時間推移逐漸上升。*：與對照組相比，P＜0.05；**：與對照組相比，P＜0.01。Fig 1 After adding 100 ng/mL human recombinant Tβ10 in SPC-A-1,cells were collected in 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h, then RT-PCR was used to detected the mRNA level of VEGF-C. Bar graph display after adding Tβ10, mRNA levels of VEGF-C in SPC-A-1 cells gradually increased over time. *: Compared with the control, P＜0.05; **: Compared with the control, P＜0.01.

圖2 SPC-A-1細(xì)胞系中加入100 ng/mL人重組Tβ10后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h，用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)VEGF-C、P-AKT和AKT蛋白變化。如圖所示，VEGF-C和P-AKT蛋白水平逐漸升高，而總AKT水平不變。*：與對照組相比，P＜0.05；**：與對照組相比，P＜0.01。Fig 2 After adding 100 ng/mL human recombinant Tβ10 in SPC-A-1,cells were collected in 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h, then Western blot was used to detected the protein level of VEGF-C, P-AKT and AKT. As the figure show, the protein level of VEGF-C and P-AKT were increased gradually, but the total AKT level were unchanged. *: Compared with the control, P＜0.05; **: Compared with the control, P＜0.01.

2.3 在SPC-A-1細(xì)胞中Tβ10可能通過促進(jìn)P-AKT水平促進(jìn)VEGF-C mRNA表達(dá) 在SPC-A-1細(xì)胞中加入Tβ10，8 h后在一組細(xì)胞中加入P-AKT特異性抑制劑LY294002，另一組細(xì)胞不加。加入抑制劑0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后分別提取細(xì)胞的mRNA，檢測其中VEGF-C水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時間的進(jìn)展，不加抑制劑組VEGF-C的水平變化很少，而加LY294002組VEGF-C mRNA含量逐漸下降，說明LY294002能明顯抑制VEGF-C表達(dá)（P＜0.05）（圖3）。

2.4 在不同細(xì)胞系中Tβ10通過上調(diào)P-AKT水平促進(jìn)VEGF-C表達(dá) 為了進(jìn)一步驗證Tβ10促進(jìn)VEGF-C表達(dá)的結(jié)論，我們又選擇了兩個細(xì)胞系：A549及LK2分別加入Tβ10和LY294002，觀察細(xì)胞中VEGF-C蛋白及mRNA變化。在兩種細(xì)胞系中加入Tβ10可以促進(jìn)VEGF-C蛋白及mRNA上調(diào)，如果在加入Tβ10的同時加入AKT通路特異性抑制劑LY294002則會使VEGF-C蛋白及mRNA水平下調(diào)（P＜0.01）（圖4，圖5）?？梢?，在肺癌細(xì)胞系中Tβ10通過上調(diào)P-AKT水平促進(jìn)VEGF-C表達(dá)。

3 討論

近年來，胸腺素類家族的小分子化合物在腫瘤中的作用受到了越來越廣泛的關(guān)注，在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了胸腺素的高表達(dá)。Tβ4在腎癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中表達(dá)增高[7,8]，而且Tβ4的高表達(dá)可能直接增加腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)會。Tβ10在乳腺癌、黑色素瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、肺癌等中表達(dá)升高[9,10]。Tβ15則在前列腺癌、乳腺癌[11]中高表達(dá)。但也有報道[5,6]某些胸腺素在腫瘤中低表達(dá)甚至缺失。這些研究表明不同種類的胸腺素在不同組織中的作用機(jī)制存在很大差異，這就需要更深入的實驗來驗證胸腺素類的生理作用。

圖3 在SPC-A-1細(xì)胞中加入Tβ10 8 h后一組加入LY294002, 另一組不加， 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h后細(xì)胞的VEGF-C mRNA變化比較，發(fā)現(xiàn)LY294002可明顯抑制Tβ10引起的VEGF-C升高。**：與對照組相比，P＜0.01。Fig 3 8 h after adding Tβ10 in SPC-A-1 cells, LY294002 was added in the medium. After 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h, mRNA levels of VEGF-C were detected. The results reveals that LY294002 significantly inhibited Tβ10 induced VEGF-C increased. **: Compared with the control, P＜0.01.

圖4 在A549和LK2細(xì)胞中加入Tβ10和LY294002，檢測細(xì)胞VEGF-C mRNA表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Tβ10能促進(jìn)這兩株細(xì)胞VEGF-C mRNA的表達(dá)，LY294002則能逆轉(zhuǎn)該變化。**：與對照組相比，P＜0.01。Fig 4 In A549 and LK2 cells after adding Tβ10 and LY294002, the mRNA level of VEGF-C was detected. Tβ10 can prompted the expression of VEGF-C, and LY294002 can inhibited the expression of VEGF-C. **: Compared with the control, P＜0.01.

圖5 在A549和LK2細(xì)胞中加入Tβ10和LY294002，檢測細(xì)胞VEGF-C蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Tβ10能促進(jìn)這兩株細(xì)胞VEGF-C蛋白表達(dá)，LY294002則能逆轉(zhuǎn)這種變化。**：與對照組相比，P＜0.01。Fig 5 In A549 and LK2 cells after adding Tβ10 and LY294002, the protein level of VEGF-C was detected. Tβ10 can prompted the expression of VEGF-C, and LY294002 can inhibited the expression of VEGF-C. **: Compared with the control, P＜0.01.

腫瘤淋巴管生成主要受VEGF-C、-D和VEGFR-3調(diào)控。近年來多數(shù)研究報道稱：惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是因為惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量VEGF-C，并通過下述3種途徑參與調(diào)節(jié)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：①VEGF-C通過與VEGFR-3受體結(jié)合，刺激誘導(dǎo)癌旁淋巴管增生，并降低淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附，增加了腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)會[12]；②提高腫瘤細(xì)胞粘附作用。能分泌VEGF-C的腫瘤細(xì)胞通過淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上受體的親和作用，使腫瘤細(xì)胞得以粘附到淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上；③VEGF-C還可作為一種趨化因子，使腫瘤細(xì)胞向淋巴管方向遷移。

我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，Tβ10在肺癌中表達(dá)上調(diào)并與肺癌淋巴管密度及VEGF-C表達(dá)密切相關(guān)，這促使我們進(jìn)一步研究Tβ10在肺癌中通過上調(diào)VEGF-C表達(dá)促進(jìn)淋巴管形成的機(jī)制。AKT和腫瘤血管及淋巴管生成密切相關(guān)，Tsutsui等[13]證明在乳腺癌中AKT可以通過VEGF-C促進(jìn)淋巴管形成。而另有文獻(xiàn)[7]報道與Tβ10同家族的Tβ4可以在內(nèi)皮細(xì)胞中促進(jìn)AKT磷酸化從而發(fā)揮Tβ4促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動的功能。因此我們推測Tβ10在肺癌細(xì)胞中可能通過促進(jìn)AKT磷酸化促進(jìn)VEGF-C的表達(dá)。

由于胸腺素是小分子多肽，根據(jù)文獻(xiàn)報道可以采用外源加入人重組蛋白的方法檢測胸腺素類的生理作用[7,14]，因此在本實驗中我們采用的是加入外源Tβ10的實驗方法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SPC-A-1細(xì)胞中加入100 ng/mL人重組Tβ10可以促進(jìn)VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)水平。為了進(jìn)一步驗證Tβ10是否是通過促進(jìn)AKT磷酸化促進(jìn)VEGF-C表達(dá)，我們又同時檢測了加入Tβ10后P-AKT的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)加入Tβ10后在VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)的同時P-AKT表達(dá)也升高，而總的AKT的水平不發(fā)生變化。如果在加入Tβ10同時又加入了P-AKT抑制劑則能明顯抑制VEGF-C表達(dá)。為了能證明我們推測的結(jié)論，我們又在另外兩株肺癌細(xì)胞系中重復(fù)了實驗，發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞系中Tβ10均能通過P-AKT通路促進(jìn)VEGF-C表達(dá)。這些實驗均說明在肺癌中Tβ10促進(jìn)淋巴管生成的功能是通過促進(jìn)AKT磷酸化進(jìn)而促進(jìn)VEGF-C表達(dá)來實現(xiàn)的。

綜上所述，Tβ10在肺癌中促進(jìn)淋巴管形成的作用是通過激活A(yù)KT通路促進(jìn)VEGF-C表達(dá)實現(xiàn)的。Tβ10在肺癌中作為一個癌基因，對它的深入研究對闡明肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尤其是腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制有著重要的意義。