都 虹，郝 杰，魯靜朝，楊秀春，崔 煒，劉 凡(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科,河北 石家莊 050000)

·論著·

辛伐他汀通過過氧化物酶體增殖物激活受體激活抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化

都 虹，郝 杰，魯靜朝，楊秀春，崔 煒，劉 凡
(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科,河北 石家莊 050000)

目的探討辛伐他汀體外恒溫孵育對膠原誘導(dǎo)的血小板活化的影響及相關(guān)機制。方法采集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院門診健康成人志愿者外周靜脈血，并制備血小板懸液，應(yīng)用全血阻抗法、流式細胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定及熒光分光光度法測定不同濃度辛伐他汀體外孵育對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集及活化的影響，檢測辛伐他汀體外孵育對血小板胞漿過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)活化的影響，以及PPARs活化后對血小板功能的作用。結(jié)果辛伐他汀體外孵育可活化PPARs(P<0.05)，并可通過活化PPARγ進而抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集、活化標志物表達以及胞漿鈣離子濃度升高。結(jié)論辛伐他汀可通過PPARγ激活抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化。

血小板活化；過氧化物酶體增殖物激活受體；辛伐他汀

血小板活化在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，活化的血小板可以通過釋放各種致炎因子促進炎癥反應(yīng)，同時血小板活化引起的血栓形成是臨床多種疾病，包括心血管事件發(fā)生的重要原因。血脂升高特別是低密度脂蛋白水平增高與血小板活化密切相關(guān)。已有研究證實，高脂血癥患者處于易栓狀態(tài)，其血栓發(fā)生概率明顯增加[1]。他汀類藥物為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是目前臨床常用的調(diào)脂藥，多項研究證實，他汀類藥物具有多種療效顯著的抗動脈粥樣硬化作用，包括抗血小板作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可直接影響血小板功能，抑制血小板活化，并且可獨立于其降低膽固醇水平之外發(fā)揮上述作用[2]，但所涉及的相關(guān)機制尚不明確。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptors，PPARs)屬于核受體超家族，參與體內(nèi)多種代謝過程的基因調(diào)控。血小板雖然是無核細胞，但已證實3種PPARs亞型均有表達，并可通過非基因調(diào)控途徑影響血小板功能[3]。本研究通過觀察辛伐他汀體外干預(yù)對膠原誘導(dǎo)的血小板活化的影響，以及對PPARs激活的作用，探討他汀類藥物抑制血小板活化的相關(guān)機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2013年3—12月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院門診健康成人志愿者30例，18～50歲，中位年齡38歲，既往均無血液病、消化系統(tǒng)等影響血小板功能的疾病，2周內(nèi)均未應(yīng)用過抗血小板藥物或其他抗凝藥物。受試者均簽署知情同意書。

1.2 藥品儀器：辛伐他汀(simvastatin)、PPARα拮抗劑(GW6471)及PPARγ拮抗劑(GW9662)購自Sigma公司，全血血小板聚集儀(MODEL-590)及膠原購自CHRONO-LOG公司,單克隆抗體anti-CD61/PerCP、anti-CD62/PE及PAC-1/FITC購自美國BectonDickinson公司，PPARs酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)試劑盒購自美國Cayman公司，熒光分光光度計(F-2500)購自北京恒昌科技有限公司,FACSCalibur流式細胞儀購自上海燦溪經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血小板懸液制備：取受試者外周靜脈血10mL，用3.8%(W/V)枸櫞酸鈉抗凝后為全血樣本。另取外周靜脈血10mL，用3.8%(W/V)枸櫞酸鈉抗凝，1 500r/min室溫(25℃)離心10min,取上部的血漿，得到富血小板血漿(platelet-richplasma,PRP)，再以2 000r/min離心10min,分離血小板，調(diào)整血小板濃度為3×108/mL，制備血小板懸液。

1.3.2 血小板聚集率測定：首先采用全血阻抗法測定不同濃度辛伐他汀(0.3 、3 、30 、50μmol/L)體外恒溫(37℃)孵育不同時間(3、5、10min)對膠原(終濃度2mg/L)誘導(dǎo)的血小板聚集的影響，隨后測定PPARα和PPARγ拮抗劑(終濃度10μmol/L)預(yù)孵育 (5min) 對不同濃度辛伐他汀(3、30、50μmol/L)體外孵育(5min) 抑制血小板聚集的影響。

1.3.3 血小板胞漿PPARs活化測定：測定不同濃度辛伐他汀(3、30、50μmol/L)，體外恒溫(37℃)孵育5min對血小板胞漿PPARs活化的影響。采用Cayman公司PPARα活性ELISA檢測試劑盒，參照說明書操作檢測PPARα活性，同法測定PPARβ和PPARγ活性。

1.3.4 血小板活性標志物表達及胞漿鈣濃度測定：利用三色流式法測定辛伐他汀(10、30μmol/L)或辛伐他汀與PPARα或PPARγ拮抗劑(終濃度10μmol/L)恒溫(37℃)共孵育 (5min) 對膠原(終濃度2mg/L)誘導(dǎo)的血小板活化標志物(CD62、PAC-1)表達的影響。采用熒光分光光度計分析辛伐他汀(3、30、50μmol/L)或辛伐他汀與PPARα或PPARγ拮抗劑(終濃度10μmol/L)恒溫(37℃)共孵育(5min) 對膠原(終濃度2mg/L)誘導(dǎo)的血小板胞漿鈣離子濃度變化的影響。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀對血小板聚集的影響：ELISA結(jié)果顯示，不同濃度辛伐他汀抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集均具有濃度和時間依賴性，即隨著孵育時間的延長和辛伐他汀濃度的增加，凝聚抑制作用越來越強(P<0.05)(圖1A)。辛伐他汀體外孵育血小板可激活PPARα及PPARγ(P<0.05)，對PPARβ無明顯活化作用(P>0.05)(圖1B)。通過測定不同濃度辛伐他汀體外恒溫孵育不同時間對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的影響，應(yīng)用PPARα及PPARγ拮抗劑(GW6471，GW9662)預(yù)孵育全血樣本后顯示，GW9662可以逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用(P<0.05)，而應(yīng)用GW6471拮抗PPARα雖有逆轉(zhuǎn)趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1C)。

圖1PPARα/γ激活對辛伐他汀抑制膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的影響
Figure1RoleofPPARα/γintheinhibitionbysimvastatinofplateletsaggregation

2.2 辛伐他汀對血小板活化標志物表達及胞漿鈣離子濃度的影響：膠原刺激可明顯增加血小板表面CD62及PAC-1表達，而辛伐他汀體外孵育可呈劑量依賴性抑制膠原誘導(dǎo)的血小板CD62和PAC-1表達升高(P<0.05)。當聯(lián)合PPARs拮抗劑孵育，PPARγ拮抗劑(GW9662)可顯著逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對血小板CD62及PAC-1表達的抑制作用(P<0.05)，而PPARα拮抗劑(GW6471)未觀察到明顯的逆轉(zhuǎn)作用(P>0.05)(圖2A，2B)。同時通過對血小板胞漿鈣離子濃度測定發(fā)現(xiàn)，膠原誘導(dǎo)血小板活化可引起胞漿鈣離子濃度升高，辛伐他汀體外孵育可明顯抑制膠原誘導(dǎo)的血小板胞漿鈣離子濃度升高(P<0.05)，當聯(lián)合PPARs拮抗劑孵育，同樣觀察到GW9662可顯著逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對血小板胞漿鈣離子濃度升高的抑制作用(P<0.05)，而GW6471未觀察到明顯的逆轉(zhuǎn)作用(P>0.05)(圖2C)。

圖2PPARα/γ激活對辛伐他汀抑制膠原誘導(dǎo)的血小板CD62，PAC-1及鈣離子濃度升高的影響
Figure2RoleofPPARα/γintheinhibitionbysimvastatinofcollagen-stimulated-plateletexpressionofCD62,PAC-1andCa2+mobilization

3 討 論

他汀類藥物具有多種抗動脈粥樣硬化作用，是目前臨床治療血脂異常及冠心病等疾病的常用藥物。它可以通過抑制脂質(zhì)合成限速步驟中的β-羥基-β-甲基戊二酰輔酶A還原酶，減少甲基戊酸的合成，從而發(fā)揮降低膽固醇的作用[4]。目前大規(guī)模循證醫(yī)學(xué)證據(jù)已經(jīng)證實，在一級或二級預(yù)防治療中應(yīng)用他汀類藥物可以降低心血管事件發(fā)生率。此外，越來越多的研究證實，他汀類藥物除具有調(diào)脂作用外，還可從多個方面發(fā)揮抗動脈硬化作用，其中包括顯著的體內(nèi)體外抗血小板作用。文獻報道，他汀類藥物口服治療，可通過改變血小板膜脂質(zhì)成分，以及藥物與血小板的親和力，進而抑制高脂血癥患者血小板活化[5]。Tannous等[6]報道，阿托伐他汀與安慰劑比較能明顯增高高脂血癥患者血小板內(nèi)NOS水平，進而抑制血凝塊形成，并促進其解聚。此外，研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物應(yīng)用早期即可對血栓及凝血過程產(chǎn)生影響[7]，目前認為，此類藥物存在獨立于降脂作用之外的抗血小板作用。

PPARs屬于核受體超家族，它們可通過調(diào)節(jié)脂代謝、脂肪酸氧化及糖代謝平衡有關(guān)蛋白基因的表達，進而影響能量代謝的多個方面。血小板雖然是無核細胞，但是近年研究證實，在血小板胞漿中，已知的PPARs3種亞型(PPARα、PPARβ/δ、PPARγ)均有表達，提示此類受體可能通過相關(guān)機制調(diào)節(jié)血小板功能。已有報道發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑如噻唑烷二酮類藥物可以抑制血小板活化，機制涉及調(diào)控磷酸肌醇代謝及增加血小板胞漿內(nèi)環(huán)單磷酸腺苷水平[8-9]。此外，PPARγ內(nèi)源性配體15d-PGJ2可以抑制血小板CD40L、血栓素A2以及內(nèi)源性促凝物質(zhì)如ADP的釋放，進而發(fā)揮抗炎及抗栓作用[10]。本研究證實，辛伐他汀具有PPARα/γ激活作用，而不影響PPARβ活化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，拮抗PPARγ可以逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對血小板活化的抑制作用，而應(yīng)用PPARα拮抗劑GW6471拮抗PPARα活性，未對辛伐他汀的抑制作用產(chǎn)生明顯影響。

血小板活化可引起血小板變形，并釋放和表達多種生物活性物質(zhì)，其中P-選擇素作為顆粒膜成分，可表達于血小板表面，被CD62結(jié)合后可用于檢測血小板活化狀態(tài)。此外，血小板活化的另一個重要特征是其表面受體，特別是GPⅡb/Ⅲa的構(gòu)象改變，應(yīng)用的PAC-1單克隆抗體可直接結(jié)合活化血小板中GPⅡb/Ⅲa構(gòu)象變化所暴露出的纖維蛋白原結(jié)合位點，因此PAC-1也是目前公認的血小板活化標志物[11]。通過對上述血小板活化標志物表達的測定證實，辛伐他汀體外孵育能夠抑制血小板活化，加用PPARs拮抗劑后，PPARγ拮抗劑(GW9662)能夠逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對PAC-1、CD62表達的抑制作用，而PPARα拮抗劑(GW6471)未觀察到明顯的逆轉(zhuǎn)作用，這進一步說明了辛伐他汀可通過PPARγ激活發(fā)揮抑制血小板活化的作用。血小板膜糖蛋白受體構(gòu)象改變及顆粒釋放等反應(yīng)發(fā)生的重要機制與血小板胞漿鈣離子濃度增高有關(guān)[12]。通過對胞漿鈣離子濃度變化的測定也證實，辛伐他汀主要通過活化PPARγ發(fā)揮抑制膠原誘導(dǎo)血小板活化的作用。

綜上所述，辛伐他汀可通過PPARs激活，特別是PPARγ活化抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化。這為研究他汀類藥物的抗血小板機制，提供了一個新的方向。然而，除血小板聚集、黏附及胞漿鈣離子濃度變化外，PPARs激活是否可以影響血小板活化的其他反應(yīng)，以及所涉及的相關(guān)機制仍需進一步研究。

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(本文編輯：許卓文)

EFFECTSOFPEROXISOMEPROLIFERATOR-ACTIVATEDRECEPTORSINSIMVASTATININHIBITIONONCOLLAGEN-INDUCEDPLATELETACTIVATION

DUHong,HAOJie,LUJingchao,YANGXiuchun,CUIWei,LIUFan
(DepartmentofCardiology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveToexaminethemechanismsbywhichtheperoxisomeproliferator-activatedreceptors(PPARs)-mediatedpathwayscontributetotheantiplateletactivityofsimvastatin.MethodsBloodsamplesweredonatedfromhealthyvolunteersinordertopreparehumanplateletsuspensions.Theeffectsofsimvastatinoncollagen-inducedplateletactivationandtheactivityofPPARsweremeasuredbyimpedanceaggregometry,flowcytometricanalysis,enzyme-linkedimmunosorbentassay,andspectrofluorimetry.ResultsSimvastatininducedPPARαandPPARγactivationinadose-dependentmannerinplateletsuspensions(P<0.05).Additionally,simvastatininhibitedcollagen-inducedplateletaggregation,expressionofCD62andPAC-1,andCa2+mobilization.TheseeffectsofsimvastatinonplateletresponseswerestronglyreducedbyaddingselectivePPARγantagonist(P<0.05),butnotPPARαantagonist.ConclusionSimvastininhibitionofplateletactivationinducedbycollagenismediatedbyPPARγ-dependentprocesses.

plateletactivation;peroxisomeproliferator-activatedreceptors;simvastin

2014-09-05；

2014-10-23

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(20130195)

都虹(1981-)，女，遼寧恒仁人，蒙古族，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士研究生，從事心血管疾病診治研究。

R331.124

A

1007-3205(2014)12-1365-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.12.001