張春梅，王麗娜，劉永亮(河北省唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000)

·論著·

丁苯酞對(duì)局灶性腦梗死大鼠皮層Rho相關(guān)激酶Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

張春梅，王麗娜，劉永亮*
(河北省唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000)

目的探索丁苯酞對(duì)局灶性腦梗死大鼠模型皮層Rho相關(guān)激酶Ⅱ(Rho-associated kinase Ⅱ,ROCKⅡ)表達(dá)的影響。方法成年Sprague-Dawley 雄性大鼠45只，隨機(jī)分為假手術(shù)組15只，對(duì)照組15只，丁苯酞組15只。應(yīng)用光化學(xué)法建立局灶性腦梗死大鼠模型。術(shù)后24h行干濕質(zhì)量法檢測(cè)各組大鼠腦組織含水量變化，行免疫組織化學(xué)和Western Blot檢測(cè)各組大鼠梗死區(qū)周圍皮層ROCKⅡ蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，對(duì)照組和丁苯酞組腦組織含水量明顯增加，梗死區(qū)周圍皮層ROCKⅡ蛋白表達(dá)明顯增加。丁苯酞組腦組織含水量較對(duì)照組降低，梗死區(qū)周圍皮層ROCKⅡ蛋白表達(dá)減少。結(jié)論丁苯酞可降低局灶性腦梗死大鼠皮層ROCKⅡ蛋白的表達(dá)，減輕腦水腫的形成。

腦梗死；丁苯酞；模型，動(dòng)物

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.004

腦水腫是腦梗死后的主要繼發(fā)性病理過(guò)程，可加重腦組織缺血缺氧，是導(dǎo)致患者病死率和殘疾率增高的主要原因之一[1]。Rho相關(guān)激酶(Rho-associatedkinase,ROCK)Ⅱ是Rho信號(hào)通路的重要底物之一，ROCKⅡ的激活可進(jìn)而激活肌球蛋白輕鏈磷酸酶，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈磷酸化，血腦屏障通透性增高，腦水腫加重[2]。丁苯酞是治療急性缺血性腦血管病的一種新藥。本研究采用光化學(xué)法制造局灶性腦梗死大鼠模型，觀察丁苯酞對(duì)局灶性腦梗死大鼠腦水腫和ROCKⅡ蛋白表達(dá)水平的影響，旨在為丁苯酞的臨床應(yīng)用探索新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠45只，體質(zhì)量280～320g，3個(gè)月齡，購(gòu)自北京維通利華公司，合格證為SCXL(京)2002-003。飼養(yǎng)于河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心，自然光照，環(huán)境安靜，維持室溫在20～25℃，自由進(jìn)食飲水。所有動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組15只，對(duì)照組15只，丁苯酞組15只。丁苯酞組大鼠給予丁苯酞軟膠囊(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，應(yīng)用植物油配制成100mg/mL)0.4mL/kg灌胃(1次/d)，假手術(shù)組和對(duì)照組給予0.4mL/kg植物油灌胃。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循國(guó)際生命指導(dǎo)中心“關(guān)心和使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則”。

1.2 模型制作：對(duì)照組和丁苯酞組大鼠采用10%水合氯醛3～5mL/kg腹腔麻醉，經(jīng)尾靜脈注入光敏劑紅四氮唑(即玫瑰紅B)150mg/kg，SR-5立體定位儀(日本Narishige公司)固定大鼠頭部，常規(guī)消毒，沿正中線切開頭皮，暴露右側(cè)顱骨，于前囟右3mm后2mm處，磨鉆磨除直徑約6mm外層顱骨，LG-150綠色冷光源[徐州恒發(fā)有限公司，波長(zhǎng)(560±30)nm，光照強(qiáng)度5.6×105，照射中心最高溫度為27℃]照射30min，縫合皮膚。假手術(shù)組僅尾靜脈注射生理鹽水，只暴露顱骨，磨除外板，照射時(shí)間同上。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉清醒后，應(yīng)用Longa標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行大鼠行為學(xué)評(píng)分。0分，無(wú)缺陷；1分，不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2分，對(duì)側(cè)前肢屈曲；3分，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分，向?qū)?cè)跌倒。評(píng)分1～3分者納入實(shí)驗(yàn)，不符合標(biāo)準(zhǔn)者隨機(jī)補(bǔ)充。

1.3 腦組織含水量測(cè)定：隨機(jī)選取各組大鼠各5只，于術(shù)后24h采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭處死，開顱取腦，從梗死周圍區(qū)取200mg左右的腦組織，應(yīng)用MA110電子分析天平(上海第二天平儀器廠)稱濕質(zhì)量并記錄，然后置于105℃恒質(zhì)量干燥箱內(nèi)干燥48h至恒質(zhì)量，稱干質(zhì)量后按Elliot公式計(jì)算腦含水量。腦含水量計(jì)算公式=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)梗死周圍皮質(zhì)ROCKⅡ蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量：隨機(jī)選取各組大鼠各5只，于術(shù)后24h采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛經(jīng)左心室穿刺至主動(dòng)脈進(jìn)行灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4℃冰箱過(guò)夜，自紅色梗死灶前邊界向后冠狀切取2mm厚包含梗死區(qū)及左右半球的組織塊，自來(lái)水沖洗48h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，片厚5μm。取各大鼠同部位切片3張，經(jīng)二甲苯二級(jí)脫蠟各5min，梯度乙醇脫水，3%過(guò)氧化氫室溫浸泡10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓熱修復(fù)，滴加1∶100比例稀釋的ROCKⅡ一抗(武漢博士德生物工程有限公司)4℃過(guò)夜，次晨取出置常溫，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加二抗，37℃孵育1h，二氨基聯(lián)苯胺顯色，水沖洗后蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)黃染。在400倍顯微鏡下在梗死灶周圍隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用ImagePro-Plus圖像分析系統(tǒng)5.0(美國(guó)MediaCybernetics公司)照相后計(jì)算每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)梗死周圍皮質(zhì)ROCKⅡ蛋白表達(dá)：應(yīng)用細(xì)胞裂解液提取各組大鼠術(shù)后24h梗死周圍腦組織總蛋白(每組各5只)運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定各個(gè)樣本蛋白含量，上樣量為100μg蛋白。15%SDSPAGE凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉；加入山羊抗ROCKⅡ(rI′11r18/serl9)多克隆一抗(1∶500)(武漢博士德生物工程有限公司)、山羊抗β-肌動(dòng)蛋白多克隆一抗(1∶1 000)(武漢博士德生物工程有限公司)，4℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)(武漢博士德生物工程有限公司)。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液(美國(guó)pierce公司)3min，曝光、顯影、定影。采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件分析平均灰度值，取目標(biāo)平均灰度值與內(nèi)參平均灰度值的比值。

2 結(jié) 果

與假手術(shù)組相比，對(duì)照組和丁苯酞組大鼠梗死24h后腦組織含水量均顯著增高(P<0.05)；丁苯酞組大鼠梗死24h后腦組織含水量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。在免疫組織化學(xué)試驗(yàn)中，假手術(shù)組可見少量被染成棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞；與假手術(shù)組相比，對(duì)照組和丁苯酞組梗死24h后梗死周圍陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均顯著增多(P<0.05)；丁苯酞組梗死24h后梗死周圍陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著減少(P<0.05)。在免疫印記試驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，對(duì)照組和丁苯酞組梗死24h后梗死周圍腦組織ROCKⅡ含量均顯著增高(P<0.05)；丁苯酞組梗死24h后梗死周圍皮質(zhì)ROCKⅡ含量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。見表1。

GroupsBrainwatercontentROCKⅡ(Immunohistochemistry)ROCKⅡ(WesternBlot)Sham71．78±0．7238．20±10．4760．80±9．68Control79．33±0．49?195．60±15．31?121．00±12．79?Butylphthalide77．49±0．34?#124．20±16．33?#86．40±9．56?# F273．122152．56939．266 P0．0000．0000．000

*P<0.05vssham group #P<0.05vscontrol group byqtest
ROCKⅡRho-associated kinase Ⅱ

3 討 論

腦梗死是一種臨床常見的缺血性腦血管病，嚴(yán)重危害著人類的生命和健康。急性缺血性腦血管病可引起局部腦組織微循環(huán)障礙，缺血缺氧，甚至引起炎癥反應(yīng)、自由基損傷、血腦屏障通透性增高等病理過(guò)程，導(dǎo)致腦水腫形成[4]。腦水腫形成后可進(jìn)一步加重腦組織缺血缺氧，并且可引起顱內(nèi)壓增高，甚至形成腦疝，明顯加重患者的癥狀，影響患者的預(yù)后[5]。因此，對(duì)腦水腫的形成機(jī)制及治療方法進(jìn)行進(jìn)一步的探討，對(duì)缺血性腦血管病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。

Rho蛋白家族是Ras超家族小相對(duì)分子質(zhì)量單體結(jié)合蛋白。Rho蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重建[6]。Rho蛋白通過(guò)Rho信號(hào)通路參與包括炎癥反應(yīng)在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程。ROCK是Rho的重要效應(yīng)底物之一，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。本研究結(jié)果表明，ROCKⅡ參與了腦梗死的病理過(guò)程。當(dāng)ROCK接受了Rho傳遞的活化信號(hào)，可發(fā)生多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的磷酸化，包括肌球蛋白磷酸酶的磷酸化[7]。肌球蛋白磷酸酶磷酸化后活性消失，肌球蛋白輕鏈脫磷酸化受阻，使得胞漿內(nèi)肌球蛋白輕鏈磷酸化水平增高，肌動(dòng)蛋白微絲骨架聚合，血管內(nèi)皮骨架發(fā)生變化，血管內(nèi)皮收縮，內(nèi)皮通透性增高[8]。我們推測(cè)，ROCKⅡ通過(guò)此途徑參與了腦梗死后腦水腫的發(fā)生。

丁苯酞是從芹菜籽中提取的一種有效成分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，丁苯酞可以增加缺血區(qū)的腦組織的血流量，重建缺血區(qū)微循環(huán)；保護(hù)線粒體功能，改善腦組織能量代謝[9]。本研究結(jié)果顯示丁苯酞可通過(guò)調(diào)控ROCKⅡ的表達(dá)減輕腦梗死后腦水腫的形成。有研究[10]表明丁苯酞還能夠減少梗死區(qū)中性粒細(xì)胞數(shù)量以及白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。細(xì)胞外血管緊張素Ⅱ和IL-1β可上調(diào)RhoA表達(dá)并增強(qiáng)其活性[11]。TNF-α可通過(guò)其受體激活RhoA，進(jìn)而激活Rho三磷酸鳥苷酶，促進(jìn)肌球蛋白輕鏈磷酸化，導(dǎo)致平滑肌對(duì)Ca2+的敏感性增高，肌動(dòng)球蛋白收縮力增大，血管平滑肌收縮，從而加重細(xì)胞毒性腦水腫[12]。由此可見，腦缺血后的應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)與Rho信號(hào)通路密切相關(guān)。此外，丁苯酞還具有抑制腦缺血患者血清C反應(yīng)蛋白表達(dá)的作用[13]，而唐淑俊等[14]的研究表明，炎性細(xì)胞因子和C反應(yīng)蛋白與腦梗死后腦水腫的關(guān)系密切。我們推測(cè)，腦梗死引起的炎癥反應(yīng)會(huì)激活RhoA，進(jìn)而激活ROCK，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈磷酸化，血腦屏障通透性增高，腦水腫加重。而丁苯酞可通過(guò)抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)，抑制ROCK的激活，從而減輕腦梗死后腦水腫的形成。

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(本文編輯：許卓文)

BUTYLPHTHALIDEONCORTEXEXPRESSIONOFRHO-ASSOCIATEDKINASEⅡINRATSAFTERFOCALCEREBRALINFARCTION

ZHANGChunmei,WANGLina,LIUYongliang*
(DepartmentofNeurosurgery,TangshanPeople′sHospitalofHebeiProvince,Tangshan063000,China)

ObjectiveToexploretheeffectofbutylphthalideonthecortexexpressionofRho-associatedkinaseⅡ(ROCKⅡ)inratsafterfocalcerebralinfarction.MethodsForty-fiveSprague-Dawleymaleratsweredividedintoshamgroup,controlgroupandbutylphthalidegroup.Themodelwasmadebyphotochemicalmethod.Afterinjury24h,brainwatercontentwasmeasuredtoobservethechangesofthebrainedema,theimmunohistochemistryandWesternBlotweredonetoexaminethecortexexpressionofROCKⅡaroundtheinfarctionarea.ResultsComparedwiththeshamgroup,thebrainwatercontentofthecontrolgroupwasmoreenhanced,thecontentofROCKⅡaroundtheinfarctionareawasincreased.Comparedwiththecontrolgroup,thebrainwatercontentofthebutylphthalidegroupwasless,thecontentofROCKⅡaroundtheinfarctionareaofbutylphthalidegroupwasdecreased.ConclusionButylphthalidecouldreducethecortexexpressionofROCKⅡinratsafterfocalcerebralinfarction,andthusalleviatethebrainedema.

braininfaction;butylphthalide;modes，animal

2014-02-22；

2014-04-30

張春梅(1973-)，女，河北唐山人，河北省唐山市人民醫(yī)院主管護(hù)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事重癥護(hù)理研究。

*通訊作者

R743.33

A

1007-3205(2014)09-1003-03