祝春華，溫 雅，王力娜，季 輝，楊 燚，劉 瑩 (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

·論著·

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ在保護(hù)大鼠腦缺血中的作用

祝春華，溫 雅，王力娜，季 輝，楊 燚，劉 瑩
(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

目的探討過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)對(duì)大鼠腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、溶劑對(duì)照組、替米沙坦組、替米沙坦+GW9662組。采用Western Blot和RT-PCR觀察大鼠腦缺血后24h時(shí)PPARγ、色素上皮源性生長(zhǎng)因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的基因和蛋白表達(dá)變化，采用干濕法測(cè)定各組腦組織含水量，采用TTG染色法測(cè)定患側(cè)腦梗死體積，采用改良Longna分級(jí)法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能。結(jié)果MCAO后24h，溶劑對(duì)照組PPARγ、PEDF表達(dá)明顯減少，而MMP-9顯著增加；替米沙坦組替米沙坦激活PPARγ能夠上調(diào)PEDF、下調(diào)MMP-9，并明顯改善神經(jīng)功能缺失，減輕腦水腫，減小梗死體積，保護(hù)缺血腦組織；替米沙坦+GW9662組合并應(yīng)用PPARγ特異性阻斷劑GW9662顯著逆轉(zhuǎn)上述保護(hù)作用。結(jié)論P(yáng)PARγ是調(diào)控腦缺血后炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性因子，激活PPARγ途徑可能成為治療腦缺血的新靶點(diǎn)。

腦缺血；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體；基質(zhì)金屬蛋白酶9

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.001

炎癥反應(yīng)是腦缺血后繼發(fā)性腦損傷的最重要原因之一，早期快速有效控制炎癥反應(yīng)能夠顯著減輕腦損傷[1]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeprolixferator-activatedreceptorsgamma,PPARγ)是關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，在抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等方面表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其是在保護(hù)缺血腦組織方面作用突出[2-3]。PPARγ能夠有效調(diào)節(jié)下游炎癥因子，如色素上皮源性生長(zhǎng)因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)等，抑制炎癥反應(yīng)。本研究選擇PPARγ激動(dòng)劑替米沙坦及其特異性阻斷劑GW9662等干預(yù)治療腦梗死大鼠，觀察其腦水腫、腦缺血體積和神經(jīng)功能缺失改善情況，探討PPARγ保護(hù)缺血腦組織的詳細(xì)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性清潔級(jí)SD大鼠84只，體質(zhì)量250～280g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑和儀器：兔抗PPARγ、抗PEDF多克隆抗體(美國(guó)SantaCraz)；兔抗MMP-9單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；替米沙坦(德國(guó)Boehringer-Ingelheim)；GW9662(美國(guó)Sigma)；電泳儀DYY-12型(北京六一儀器廠)；多功能酶標(biāo)儀Synergy-HT(美國(guó)Bio-Tek)；聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf)；熒光定量PCR儀7500(美國(guó)ABI)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成：上海生物工程公司合成，引物序列如下。PPARγ，擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA全長(zhǎng)為207bp，引物序列，上游5′-GAAGACATCCCGTTCA-CAAGA-3′，下游5′-TGATGCTTTATCCCCACAGAC-3′；MMP-9，擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA全長(zhǎng)為187bp，引物序列，上游5′-CAGATGATGGGAGAGAAGCAG-3′，下游5′-TGTTATGATGGTGCCACTTGA-3′；PEDF，擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA全長(zhǎng)為200bp，引物序列，上游5′-CTGTGAGAGTCCCCATGATGT-3′，下游5′-AGGGG-CAGGAAGAAGATGATA-3′；β-actin，擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA全長(zhǎng)為150bp，引物序列，上游5′-GGAGATTA-CTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTAC-TCCTGCTTGCTG-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型：隨機(jī)將SD大鼠84只分為假手術(shù)組、溶劑對(duì)照組、替米沙坦組、替米沙坦+GW9662組。線栓法建立大鼠永久性右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型。手術(shù)前1h給予替米沙坦溶于生理鹽水(30mg/kg)灌胃，并給予GW9662(4mg/kg)腹腔注射。術(shù)后24h處死，留取腦組織標(biāo)本。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分;處死之前，采用改良的Longa分級(jí)法單盲進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。0分，無(wú)缺陷；1分，不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2分，對(duì)側(cè)前肢屈曲；3分，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分，向?qū)?cè)跌倒(n=6)。

1.2.3 測(cè)定腦組織含水量：斷頭取腦，冠狀切開(kāi)去除額極，取雙側(cè)腦組織約2mm厚，采用干濕法測(cè)定腦組織含水量，腦組織含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100% (n=8)。

1.2.4 測(cè)定腦梗死體積：斷頭取腦，均勻切成5片冠狀切片，浸入2% 2，3，5-氧化三苯基甲氮唑溶液，37℃染色30min后4%多聚甲醛中固定24h。梗死體積(百分比)=(矯正梗死體積/非缺血側(cè)半球體積)×100% (n=6)。

1.2.5PEDF和PPARγ蛋白和基因表達(dá)：取各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物梗死側(cè)皮層腦組織，置-80℃凍存?zhèn)溆谩２捎肳esternBlot檢測(cè)PPARγ、PEDF和MMP-9蛋白表達(dá)，計(jì)算PPARγ/β-actin、PEDF/β-actin和MMP-9/β-actin比值(n=4)。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)PPARγ、PEDF和MMP-9mRNA表達(dá)，內(nèi)參基因β-actin，得到目的基因表達(dá)的CT值，與對(duì)照組相比，我們采用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析(n=3)。

2 結(jié) 果

2.1 替米沙坦激活PPARγ改善神經(jīng)功能：術(shù)后24h，假手術(shù)組行為學(xué)評(píng)分均為0分。與溶劑對(duì)照組(4.00±0.81)分和替米沙坦+GW9662組(3.76±0.68)分比較，替米沙坦組(2.40±1.32)分，神經(jīng)功能障礙明顯改善(F=2.482，P<0.05)；溶劑對(duì)照組與替米沙坦+GW9662組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 替米沙坦激活PPARγ顯著減輕患側(cè)腦水腫：術(shù)后24h，替米沙坦組、溶劑對(duì)照組和替米沙坦+GW9662組3組患側(cè)腦組織有明顯的水腫(P<0.05)；與溶劑對(duì)照組和替米沙坦+GW9662組比較，替米沙坦組患側(cè)腦水腫明顯減輕(P<0.05)。對(duì)側(cè)腦組織含水量4組之間無(wú)差別，見(jiàn)表1。

GroupsIpsilateralContralateralSham78．22±0．3978．88±0．47Vehicle84．09±0．55?78．11±0．30Telmisartan82．08±0．77?#78．54±0．67Telmisartan+GW966286．04±0．69?78．74±0．63 F2．920 P0．027

*P< 0.05vssham group #P< 0.05vsvehicle and telmisartan+GW9662 group byqtest

2.3 替米沙坦激活PPARγ顯著減小腦梗死體積：與溶劑對(duì)照組(53.42±7.09)%和替米沙坦+GW9662組(44.94±7.95)%比較，替米沙坦組(35.08±3.09)%缺血性病灶體積明顯減小(F=1.317，P<0.05)；替米沙坦+GW9662組與溶劑對(duì)照組比較病灶大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 替米沙坦激活PPARγ上調(diào)PEDF 、下調(diào)MMP-9蛋白和基因表達(dá)：Western Blot和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，相比假手術(shù)組，溶劑對(duì)照組和替米沙坦+GW9662組PEDF和PPARγ蛋白以及基因表達(dá)明顯下降(P<0.05)，MMP-9表達(dá)明顯增加(P<0.05)；替米沙坦組與溶劑對(duì)照組和替米沙坦+GW9662組比較，PEDF和PPARγ蛋白以及基因表達(dá)明顯上調(diào)，MMP-9表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表2，3和圖1。

GroupsPPARγPEDFMMP?9Sham0．368±0．1130．904±0．5030．003±0．001Vehicle0．070±0．032?0．121±0．062?0．103±0．030?Telmisartan0．284±0．084#0．842±0．470#0．042±0．023#Telmisartan+GW96620．073±0．043?0．180±0．141?0．081±0．011? F2．1982．3112．299 P0．0140．0160．031

*P< 0.05vssham group #P< 0.05vsvehicle and telmisartan+GW9662 group byqtest
PPARγ:peroxisome proliferator-activated receptor gamma;PEDF:pigment epithelium-derived factor;MMP-9:matrix metalloproteinase-9

圖1 替米沙坦調(diào)節(jié)PEDF和MMP-9蛋白

Figure 1 Telmisartan regulates PEDF and MMP-9 protein by Western Blot

GroupsPPARγPEDFMMP?9Sham1．000±0．2511．000±0．3931．000±1．260Vehicle0．161±0．022?0．174±0．038?10．731±5．833?Telmisartan0．709±0．168#0．851±0．315#2．117±1．082#Telmisartan+GW96620．210±0．143?0．266±0．147?9．068±1．981? F2．6942．8882．183 P0．0290．0180．011

*P< 0.05vssham group #P< 0.05vsvehicle and telmisartan+GW9662 group byqtest
PPARγ: peroxisome proliferator-activated receptor gamma;PEDF: pigment epithelium-derived factor;MMP-9: matrix metalloproteinase-9

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，腦缺血早期PPARγ和PEDF 表達(dá)明顯減少，MMP-9明顯增多，顯著的炎癥反應(yīng)伴有腦水腫和神經(jīng)功能缺失出現(xiàn)；替米沙坦激活PPARγ上調(diào)PEDF、下調(diào)MMP-9水平，顯著減輕腦水腫，減小腦缺血體積，改善神經(jīng)功能，而PPARγ特異性阻斷劑GW9662阻斷了上述作用。因此，PPARγ作為上游核轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)PEDF 、下調(diào)MMP-9表達(dá)，在腦缺血后炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用，減輕繼發(fā)性腦損傷。

PPARγ是核激素受體超家族過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 (peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)的3個(gè)亞型之一。作為配體依賴性的核轉(zhuǎn)錄因子，活化的PPARγ因在調(diào)節(jié)糖類吸收、脂肪代謝、細(xì)胞增殖和分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等機(jī)制方面作用突出而備受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外研究[2-7]發(fā)現(xiàn)，PPARγ還參與腦缺血后炎癥反應(yīng)和神經(jīng)保護(hù)等過(guò)程，激活的PPARγ能夠顯著減小實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦梗死體積，抑制腦缺血后炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)因子的表達(dá)，減輕繼發(fā)性腦損傷。研究[7-8]證明，敲除PPARγ基因，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血體積顯著增大。進(jìn)一步證明PPARγ在腦缺血后繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮至關(guān)重要作用。

替米沙坦是臨床常用的血管緊張素受體阻斷劑類抗高血壓藥物。近年國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)定，替米沙坦是PPARγ的激活劑[9]。經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究證明，替米沙坦對(duì)腦缺血具有明確的保護(hù)作用，其作用不僅通過(guò)經(jīng)典的腎素-血管緊張素-醛固酮途徑，而且多通過(guò)依賴激活的PPARγ減輕炎癥反應(yīng)，顯著減小腦缺血體積[2,10-11]。

本研究結(jié)果證明，PPARγ是調(diào)控腦缺血后炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，這僅僅是PPARγ復(fù)雜調(diào)控機(jī)制中的一部分，仍有大量工作需要完成。通過(guò)激活PPARγ可能成為治療腦缺血的理想靶點(diǎn)。

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(本文編輯：劉斯靜)

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《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》編輯部

PROTECTIVEROLEOFPEROXISOMEPROLIFERATOR-ACTIVATEDRECEPTORGAMMAINRATBRAINAGAINSTFOCALCEREBRALISCHEMIA

ZHUChunhua,WENYa,WANGLina,JIHui,YANGYi,LIUYing
(DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveThisstudyistoexploreperoxisomeproliferator-activatedreceptorgamma(PPARγ)protectingratbrainagainstfocalcerebralischemicstrokeanditsmechanism.MethodsMaleSprague-Dawleyratsweresubjectedtopermanentmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO).Sprague-Dawleyratswererandomlydividedintofourgroupssham-operatedgroup,vehiclegroup,telmisartangroup,andtelmisartan+GW9662group.At24hafterfocalcerebralischemia，theexpressionofPPARγ,pigmentepithelium-derivedfactor(PEDF),matrixmetalloproteinase-9(MMP-9)wereexploredbywesternblotandRT-PCR.Thewatercontentofbraintissuewasmeasuredbydry-wetweightmethod,theinfarctvolumewasdetectedbyTTCstain,andthenervefunctionswereevaluatedwiththeimprovedLongvamethod.ResultsAt24hafterMCAOPPARγandPEDFexpressionsignificantlydecreased,whileMMP-9increasedinvehiclegroup.TelmisartanactivatingPPARγdramaticallyup-regulatedPEDFanddown-regulatedMMP-9,alleviatedtheneurologicaldeficits,brainwatercontentandinfarctvolumeintelmisartan+GW9662group,whichwereallabolishedbyGW9662blockingPPARγasshownintelmisartan+GW9662group.ConclusionPPARγisthekeyfactorinmodulatingtheinflammatoryreactionssecondarytofocalcerebralischemia.PPARγmightbethepotentialtherapeutictargetforfocalcerebralischemia.

brainischemia;peroxisomeproliferator-activatedreceptors;matrixmetalloproteinases9

2014-04-02；

2014-07-05

祝春華(1978-)，女，河北唐山人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事腦血管疾病診治研究。

R743.31

A

1007-3205(2014)09-0993-04