鐘祥龍　張強　趙越　姜濤

[摘要] 目的 探討醋酸阿托西班的固相合成工藝及純化方法，以得到高純度醋酸阿托西班。方法 采用Fmoc氨基酸為原料，采用固相合成方法，以Rink-AM樹脂為載體，TBTU/HOBt為縮合劑催化合成直鏈肽，以碘/乙醇液為氧化劑，采用固相環(huán)化，兩個游離單巰基的氧化生成二硫鍵而得到目標環(huán)肽，體積比例為95/2.5/2.5裂解液TFA/EDT/Water裂解，制得阿托西班粗品，液相分析粗品的純度為86.24%，制備反相高效液相色譜法純化，制得醋酸阿托西班，純度>98%。 結(jié)果 合成醋酸阿托西班粗品，經(jīng)制備反相高效液相色譜純化，純度>98%。 結(jié)論 該方法簡單，合成成本低，純度高，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞] 阿托西班；固相合成；HPLC；純化；工藝研究

[中圖分類號] R286.0 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）07（b）-0017-05

醋酸阿托西班注射液是由Ferring GmbH研制的一種新的抗早產(chǎn)藥，為歐洲醫(yī)藥學(xué)會推薦的一線用藥，是一種縮宮素的競爭性抑制劑，通過結(jié)合在子宮肌層和蛻膜的縮宮素受體上，阻止縮宮素在靶細胞上發(fā)揮作用，從而達到預(yù)防早產(chǎn)的療效[1-3]。

阿托西班是一條由9個氨基酸組成的二硫鍵型的環(huán)肽多肽，是1，2，4和8位修飾的縮宮素分子，肽的N端為3-巰基丙酸（巰基與[Cys]6的巰基形成二硫鍵），C端為酰胺的形式。N端第二個氨基酸是乙基化修飾的[D-Tyr（Et）]2。阿托西班在藥品中以醋酸鹽的形式存在，通用名為醋酸阿托西班，肽序如下：

目前國內(nèi)外專利或文獻[4-6]所報道的大多數(shù)是通過固相化學(xué)合成方法來得到阿托西班，所以本研究采用Fmoc/tbu策略的固相化學(xué)合成路線，用逐步縮合的策略成功合成了九肽的阿托西班。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Synthware固相合成反應(yīng)柱（北京欣維爾）；JJ1000型精密電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵（鞏義予華儀器有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；液相分析儀器（島津LC-10Avp）；液相分析色譜柱（島津VP-ODS，4.6×150 mm）；JBR-1型多肽合成儀（海南建邦）。

1.2 試劑

Rink AM樹脂（批號：GRMK0305，替代度：0.32 mmol/g，天津南開和成科技有限公司）；Rink AM樹脂（批號：GRML0101，替代度：0.93 mmol/g，天津南開和成科技有限公司），F(xiàn)moc保護的氨基由上海吉爾生化科技有限公司提供，包括：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Orn（Boc）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys（Trt）-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr（Et）-OH、Mpa（Trt）-OH；縮合劑TBTU/HOBt由蘇州中科天馬肽工程中心有限公司提供；市售阿托西班進口制劑對照品（批號：AC0089G，生產(chǎn)廠家：Ferring GmbH）；哌啶、吡啶、三氟乙酸（TFA）、三異丙基硅烷（TIS）、苯甲硫醚（thioanisole）、苯酚（phenol）、乙二硫醇（EDT）、N，N-二異丙基乙胺（DIEA）、醋酸酐（AC2，O）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、冰乙醚和二氯甲烷（DCM）、二甲基亞砜（DMSO）和過氧化氫溶液（H2O2）均為分析純；乙腈（色譜純，天津科密歐試劑有限公司），超純水為實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿托西班合成方法摸索

2.1.1 樹脂類型的選擇 因為阿托西班羧基端是肽酰胺的形式，常用有兩種方法可以得到：①用2-氯三苯甲基氯樹脂先組裝肽鏈后，選擇性切割成全保護的肽片段，然后在液相中將肽羧酸酰胺化，再脫除側(cè)鏈保護基得到目標肽；②直接從氨基類樹脂起始合成后，切割即得到目的肽酰胺。目前，氨基類樹脂已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和供應(yīng)，本研究選擇步驟較少的方法②——選用Rink AM樹脂作為固相合成的起始樹脂[7-8]。

2.1.2 樹脂的替代度選擇 通常樹脂的替代度高低選擇是根據(jù)肽鏈的長短來選擇合適的范圍，阿托西班為九肽化合物，相對肽鏈較短。市售的Rink AM樹脂替代度一般在0.3～0.9 mmol/g，據(jù)此選擇低、高水平兩種規(guī)格的Rink AM樹脂（0.32 mmol/g，批號：GRMK0305；0.93 mmol/g，批號：GRML0101），按常規(guī)逐步偶聯(lián)得到阿托西班肽樹脂，再裂解得到阿托西班線形肽來進行對比試驗，以肽樹脂增重率、線型肽收率為考察標準，評價替代度水平高低對反應(yīng)的影響（表1）。

由表1結(jié)果可見，0.32、0.93 mmol/g兩種高低替代度規(guī)格的Rink AM樹脂的合成結(jié)果在肽樹脂增重率、線型肽收率方面有明顯差別。因此，選用低替代度的Rink AM作為阿托西班固相合成的樹脂載體。

2.2 氨基酸投料比的選擇

文獻中[4]報道的多為2～5倍的投料量，本實驗設(shè)計了氨基酸投料比分別為2.0、3.0、4.0、5.0 eq. 4個水平的平行實驗，條件見表2。通過逐步偶聯(lián)得到阿托西班肽樹脂，再裂解得到阿托西班線形肽，考察肽樹脂增重率、固體線性肽收率及粗肽純度等指標，來確定最優(yōu)的投料比（表3）。

由表3結(jié)果可見，2.0、3.0倍氨基酸投料比，肽樹脂增重率，線型肽收率及粗肽純度均較低，而4.0、5.0倍氨基酸投料結(jié)果無明顯差異且較高，結(jié)合成本因素，本研究選擇4.0倍的氨基酸投料比。

2.3 激活劑的選擇

多肽合成中的激活劑大多數(shù)是通過活化羧基完成肽鍵縮合反應(yīng)，目前可用于肽鍵縮合的試劑和縮合方法較多，常見的有?；B氮物法、酸酐法、碳二亞胺法、活化酯法、磷鎓鹽試劑法、脲鎓鹽試劑法等[9-10]。這些縮合方法及縮合試劑均具有各自的特點，綜合成本、激活效率、安全因素等考慮，本研究采用TBTU/HOBt組合來作為主要的激活劑。

2.4 溫度和反應(yīng)時間的確定

多肽縮合反應(yīng)為較溫和的化學(xué)反應(yīng)，對溫度要求并不苛刻，通常的潔凈區(qū)的18～26℃溫度范圍內(nèi)均是較適宜的反應(yīng)溫度；在此溫度范圍內(nèi)，每個氨基酸偶聯(lián)的時間可以通過經(jīng)典的游離氨基檢測方法——茚三酮（Kaiser test）檢驗法來確定偶聯(lián)反應(yīng)終點，此方法的靈敏度及準確度已經(jīng)得到研究者一致認可[11]。

2.5 裂解過程捕獲劑的選擇

肽鏈組裝完畢后需要用強酸[Fmoc/tBu化學(xué)通常選用三氟乙酸（TFA）作為酸切割劑]將肽鏈從樹脂上釋放出來，在切割肽的同時側(cè)鏈保護基團也會被相應(yīng)的脫除，這時需要捕獲劑來捕獲側(cè)鏈保護基團形成的正碳離子等活性離子，以避免其再次與多肽氨基酸殘基的活性側(cè)鏈基團結(jié)合生成副產(chǎn)物，根據(jù)Fmoc/tbu策略選擇的氨基酸側(cè)鏈保護基團主要有三苯甲基（Trt）、叔丁基（tBu）、叔丁氧羰基（Boc）3種，根據(jù)文獻報道[9]，常用乙二硫醇和水作為捕獲劑，因此選擇EDT和水作為捕獲劑。

裂解液的組成為TFA/EDT/Water=95/2.5/2.5（v/v）。

2.6 環(huán)化方法篩選

阿托西班結(jié)構(gòu)中含有一對二硫鍵，其形成是通過兩個游離單巰基的氧化得到。氧化方法按載體分主要有固相環(huán)化法與液相環(huán)化法[7，12-13]兩種。環(huán)化方法需要選擇的條件包括氧化劑、環(huán)化濃度、pH等。

本實驗設(shè)計了用碘作為氧化劑的固相環(huán)化和液相環(huán)化兩種方法，其中液相環(huán)化又設(shè)計了線型肽溶解濃度分別為0.5、1、5 mmol/L 3個水平的平行環(huán)化實驗，所使用的肽樹脂合成方法參見表4，環(huán)化實驗條件參見表5，通過比較環(huán)化粗肽純度來選擇最佳的方法或濃度。

首先按表4的合成條件完成肽樹脂的偶聯(lián)，再按表5環(huán)化條件進行固相或液相環(huán)化。液相環(huán)化反應(yīng)的效果和反應(yīng)終點，可以用HPLC來監(jiān)測，固相環(huán)化的環(huán)化效果則需采用先取樣裂解后再通過HPLC檢測的方法，HPLC分析色譜條件參見“2.3”項下，實驗結(jié)果見表6。

由表6可見，固相環(huán)化和低肽濃度液相環(huán)化的純度都比較高，考慮到操作方便，本研究采用固相環(huán)化的方法，氧化劑為碘/乙醇液。

2.7 阿托西班合成方法的步驟

2.7.1 Fmoc-Gly-rink-AM resin 樹脂的制備 以0.32 mmol/g Rink AM為載體，用DMF溶脹30 min，抽去；DMF洗滌樹脂2次，每次2～5 min。

2.7.2 Atosiban -rink-AM resin 樹脂的制備 加入20%PIPE/DMF脫Fmoc保護15 min；去Fmoc保護后洗滌，用DMF洗滌樹脂3次抽干，每次2～5 min，茚三酮檢測顯藍黑色；配制氨基酸偶聯(lián)液，以4倍的氨基酸投料比，稱取Fmoc-Gly-OH和HOBt，加入DMF混合溶解澄清，緩慢加入TBTU，混勻后加入到盛有樹脂的反應(yīng)器中，開始偶聯(lián)反應(yīng)；反應(yīng)2 h后，取少量樹脂洗滌后，茚三酮監(jiān)測反應(yīng)終點，當樹脂及溶液不顯色，表明反應(yīng)完全；偶聯(lián)完畢后，DMF洗滌1次，2～5 min。按照阿托西班氨基酸序列自C端向N端依次在樹脂上偶聯(lián)，直到最后Mpa偶聯(lián)完畢，加入20%PIPE/DMF脫Fmoc保護15 min；DMF洗滌3次，每次2～5 min，DCM洗滌3次，每次2～5 min，抽干樹脂；樹脂抽真空30℃以下干燥[7，14]。

2.7.3 線型肽樹脂環(huán)化 環(huán)化：線型肽樹脂中加入5%醋酸水溶液，配制碘/乙醇溶液，滴加至上述肽溶液中，1 h后，HPLC監(jiān)測環(huán)化終點，氧化完畢得到Atosiban-rink-AM resin。

2.7.4 Atosiban-rink-AM resin 樹脂的裂解 配制體積比例為95/2.5/2.5裂解液TFA/EDT/Water，數(shù)量為15 ml/g肽樹脂，冰浴下加入到干燥的樹脂中，加入完畢后升溫至室溫反應(yīng)150 min，過濾樹脂，用TFA少量洗滌樹脂，合并濾液，濃縮除去大部分三氟醋酸后，傾入冷的乙醚中析出沉淀，離心收集沉淀，用冷乙醚洗滌沉淀3次，真空干燥[15-16]，得Atosiban粗品；收率為106.89%。經(jīng)過液相分析得到環(huán)肽粗品的純度為86.24%。

2.8 醋酸阿托西班粗品純化

2.8.1 阿托西班粗品溶液成分鑒定分析 對阿托西班粗品水溶液進行分析（圖1），色譜條件具體如下。流動相A：0.1%TFA水溶液；流動相B：乙腈，B相30%～45%，梯度洗脫30 min；紫外檢測波長：215 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫[17-18]。再用市售制劑醋酸阿托西班注射液（批號：AC0089G）作為對照品以確定樣品的出峰位置，得到色譜圖（圖2）。通過與樣品色譜圖比較，證明粗品液中保留時間為12.8 min峰為目標產(chǎn)物。

2.8.2 阿托西班粗品水溶液的純化制備 將約含2 g阿托西班的粗品水溶液，用制備反相高效液相分離純化，制備柱Novasep，色譜條件具體如下。流動相A：0.1%TFA水溶液；流動相B：乙腈，B相24%～34%，梯度洗脫60 min；紫外檢測波長：230 nm；流速：70.0 ml/min；柱溫：室溫。分段收集目標峰，經(jīng)高效液相檢測合并組分，最后得到主峰純度>98%的組分。

3 討論

多肽的固相合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從羧基端（C端）向氨基端（N端）合成。固相合成法雖然減輕了每步產(chǎn)品提純難度，但無法純化中間體，終產(chǎn)物必須純化[19]。

本研究對Fmoc/tbu的固相合成路線主要關(guān)鍵參數(shù)進行摸索和工藝條件確定，摸索的關(guān)鍵參數(shù)包括樹脂類型、樹脂替代度、氨基酸投料比、激活劑種類、反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間、環(huán)化方法以及捕獲劑種類。選用的低替代度Rink AM樹脂作為固相合成的起始樹脂，步驟較少，易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和供應(yīng)。4.0倍的氨基酸投料比，純度及產(chǎn)率高，選用TBTU/HOBt組合來作為主要的激活劑，安全有效。茚三酮檢驗法來確定偶聯(lián)反應(yīng)終點，方法靈敏及準確，碘/乙醇固相環(huán)化方法，得到粗品純度高。經(jīng)制備型高效液相純化后，純度達98%以上，總收率高，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供借鑒。

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（收稿日期：2014-05-23 本文編輯：林利利）

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（收稿日期：2014-05-23 本文編輯：林利利）