陸琳　解瑋佳　李云生等

摘要：采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法研究了培養(yǎng)溫度、pH值和貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響，結(jié)果表明：培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響較大，25～30 ℃下培養(yǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)生長(zhǎng)較好，且以25 ℃最佳；花粉在外源pH值為4～6的條件下能夠正常萌發(fā)，且最適合其萌發(fā)的pH值為4.5～5.0，萌發(fā)率達(dá)87%；室溫、4 ℃、-18 ℃等3種貯藏方式中以-18 ℃的貯藏效果最佳，貯藏4個(gè)月后的花粉萌發(fā)率仍有68.3%。

關(guān)鍵詞：大喇叭杜鵑；花粉萌發(fā)；溫度；pH值；貯藏

中圖分類號(hào)： S685.210.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0186-02

收稿日期：2013-10-22

基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃（編號(hào)：2011EB110）。

作者簡(jiǎn)介：陸琳（1976—），女，云南昆明人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事云南特色園林花卉的種質(zhì)資源創(chuàng)新研究。Tel：（0871）65892602；E-mail：Lu_lin2005@sina.com。

通信作者：李樹發(fā)，男，碩士，研究員，主要從事云南特色花卉新品種選育及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用研究。Tel：（0871）65892602；E-mail：lsf206498@126.com。云南省是杜鵑花的世界分布中心之一，有著豐富的種質(zhì)資源[1-3]。大喇叭杜鵑（Rhododendron excellens Hemsl.et Wils.）為杜鵑花科杜鵑花屬常綠灌木，主要分布在云南省內(nèi)，且分布范圍較小而集中，大部分分布于滇東南地區(qū)的文山州境內(nèi)，在玉溪和紅河以及臨滄也有少量分布。大喇叭杜鵑花大而密集，花形獨(dú)特，具有較高的觀賞價(jià)值，是培育高山杜鵑大花品種的優(yōu)良親本資源[4-5]?；ǚ刍盍χ苯优c育種效率有關(guān)，而杜鵑花花粉活力及其貯藏方法的研究是開展高山杜鵑良種培育的前提。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的花粉萌發(fā)條件不盡相同[6]，如蘋果屬（Malus）植物花粉在pH值 4.0～9.0之間都能正常萌發(fā)[7]；Holdaway-Clarke 等研究發(fā)現(xiàn)，臺(tái)灣百合花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)都會(huì)受外源pH值變化的影響[8]。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)條件及貯藏方法的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)溫度、pH值、貯藏溫度及其貯藏時(shí)間進(jìn)行研究，擬探討大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)所需的條件，了解其花粉的貯藏耐性，旨在解決花期不遇、異地授粉等雜交中的實(shí)際困難，為高山杜鵑的雜交育種提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)材料大喇叭杜鵑花粉采自云南省麻栗坡縣下金廠鄉(xiāng)干壩子，地理位置23°07′27.58″N、104°49′21.70″E，海拔1 858～1 891 m。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1花粉粒的收集于散粉前采集大喇叭杜鵑的花藥，采用陰干法置于硅膠中干燥24～48 h，見花粉粒分離開時(shí)采集花粉。

1.2.2花粉生活力的測(cè)定采用花粉離體萌發(fā)法測(cè)定花粉的生活力，離體培養(yǎng)法的培養(yǎng)基配方為50 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+50 mg/L氯化鈣+0.7%瓊脂。用玻璃棒加1～2滴培養(yǎng)液于載玻片上，稍冷卻后用干凈的毛筆蘸取少許花粉均勻撒播于培養(yǎng)基表面，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)6 h后觀察花粉萌發(fā)情況。每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)（即培養(yǎng)4個(gè)載玻片），每個(gè)重復(fù)選取2個(gè)隨機(jī)視野（本試驗(yàn)采用200倍視野），每個(gè)視野中應(yīng)不少于50粒花粉，記錄發(fā)芽率，相關(guān)計(jì)算公式如下。

發(fā)芽率=視野內(nèi)已發(fā)芽的花粉數(shù)/視野內(nèi)的花粉粒總數(shù)×100%。

1.2.3不同溫度條件對(duì)花粉萌發(fā)率的影響在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下培養(yǎng)大喇叭杜鵑花粉。6 h后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，比較不同溫度條件下花粉萌發(fā)率的差異。

1.2.4外源pH值梯度的設(shè)定采用花粉培養(yǎng)基（測(cè)定pH值為5.6），用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl對(duì)培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行梯度調(diào)節(jié)，分別設(shè)pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0、7.5。

1.2.5不同貯藏條件及不同貯藏時(shí)間下花粉萌發(fā)力的測(cè)定將干燥后的花粉分別裝入45個(gè)1.5 mL的離心管中，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。為了避免濕度的影響，在離心管中預(yù)先鋪1層扇形的吸水紙，并采用以下3種方法密封保存大喇叭杜鵑花粉：常溫保存、4 ℃冰箱保存、-18 ℃冰箱保存。從花粉貯藏起開始，每隔一定時(shí)間（1、2、4、5、6個(gè)月）定期檢測(cè)花粉萌發(fā)率。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小差異法（LSD）分析（P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

由圖1-A可以看出，培養(yǎng)溫度在5～15 ℃時(shí)，花粉萌發(fā)率幾乎為0；當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到20 ℃時(shí)，花粉萌發(fā)數(shù)量急劇升高，萌發(fā)率達(dá)到48.9%；當(dāng)培養(yǎng)溫度在25 ℃時(shí)，花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值，為87.0%；當(dāng)培養(yǎng)溫度進(jìn)一步升高，花粉萌發(fā)率開始下降，30 ℃時(shí)的萌發(fā)率為60%，35 ℃時(shí)的萌發(fā)率下降到408%，而當(dāng)培養(yǎng)溫度高達(dá)40 ℃時(shí)，萌發(fā)率降為0。說(shuō)明培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響較大，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃。

2.2pH值對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

由圖1-B可以看出，花粉在pH值為4.0～6.0的條件下能正常萌發(fā)，其萌發(fā)率在40%～87%之間；而當(dāng)pH值為極酸的35和中性偏堿的6.5～7.5時(shí)，大喇叭杜鵑花粉均不會(huì)萌發(fā)，其萌發(fā)率為0；當(dāng)pH值在4.0～5.5時(shí)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率均能達(dá)到69%以上，且當(dāng)pH值為4.5時(shí)，其花粉萌發(fā)率達(dá)到最大值，為87%。說(shuō)明大喇叭杜鵑花粉對(duì)pH值較為敏感，在過(guò)度偏酸和中性偏堿的培養(yǎng)件條件下，其花粉均不能萌發(fā)。endprint

2.3貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

貯藏前的大喇叭杜鵑花粉有較高的生命力，其花粉萌發(fā)率達(dá)91.7%，適宜授粉。從表1可以看出，在室溫、4 ℃、-18 ℃ 等3種貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率均降低，并且以室溫條件下的花粉萌發(fā)率下降得最快。室溫貯藏1個(gè)月后，花粉萌發(fā)率降低至581%，貯藏2個(gè)月后為37.6%，4個(gè)月后其花粉萌發(fā)率已降為46%，6個(gè)月時(shí)已降為0；4 ℃條件下，其花粉萌發(fā)率的降低速度相對(duì)緩慢，貯藏2個(gè)月后的花粉萌發(fā)率為68.7%，貯藏4、5個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為12.2%、21.3%，而6個(gè)月后則降至1.4%；-18 ℃下的花粉貯藏效果最好，貯藏1個(gè)月后的花粉萌發(fā)率與新鮮花粉相當(dāng)，達(dá)90.1%，至4個(gè)月時(shí)其萌發(fā)率依然大于60.0%，貯藏5、6個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為47.3%、15.0%。

3結(jié)論與討論

花粉是植物有性繁殖進(jìn)行遺傳物質(zhì)傳遞的載體，其活力直接影響傳遞的成敗。因此在進(jìn)行授粉之前，首先要對(duì)花粉的活力進(jìn)行檢測(cè)?；ǚ鄣纳盍σ蚱贩N而異，并且隨著外界的影響（溫度、濕度、輻射、貯藏條件）而變化。Wolukau等認(rèn)為，梅花花粉的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃[9]；Burke等認(rèn)為，棉花花粉的適宜的培養(yǎng)溫度為20～37 ℃[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)生長(zhǎng)有明顯影響，其花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，過(guò)高的培養(yǎng)溫度則會(huì)抑制花粉萌發(fā)。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，在pH值為4.0～6.0的條件下，大喇叭杜鵑花粉能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，且萌發(fā)率達(dá)到40%以上，最大萌發(fā)率為87%，當(dāng)pH值在3.5或6.0～7.5時(shí)，花粉就不能萌發(fā)，最適合大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的pH值為4.5。這與蘋果屬花粉、甜橙花粉等極不相同，蘋果屬、甜橙等植物的花粉在pH值為4.0～9.0之間都能夠正常萌發(fā)，甜橙花粉最適的pH值為6.0～7.0[11]；而七子花在pH值為5.5～8.0條件下均能萌發(fā)，最適 pH值為7，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件均不利于大部分植物離體花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，大喇叭杜鵑的花粉在強(qiáng)酸下最適合萌發(fā)，這與其實(shí)際的生長(zhǎng)環(huán)境極其相關(guān)。

影響花粉壽命的關(guān)鍵因素是花粉含水量和貯藏溫度，低溫、干燥處理是長(zhǎng)期保存花粉的必要條件[13-15]。有研究表明，將不同品種的飛燕草花粉干燥并貯藏在-30 ℃條件下，經(jīng)過(guò)180 d后仍然保持較高的萌發(fā)率和較長(zhǎng)的花粉管[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率逐漸下降；適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏有利于延長(zhǎng)大喇叭杜鵑花粉的壽命，貯藏在-18 ℃下的花粉經(jīng)過(guò)1個(gè)月后仍然保持90.1%的萌發(fā)率，與貯藏前花粉的萌發(fā)率（91.7%）相比僅僅下降了1.6百分點(diǎn)。總體看來(lái)，低溫保存是目前植物種質(zhì)資源保存中較理想的途徑，低溫貯藏的大喇叭杜鵑花粉可直接用于雜交育種中進(jìn)行授粉，從而為進(jìn)一步培育新品種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為將來(lái)用超低溫保存技術(shù)對(duì)其長(zhǎng)期保存作了基礎(chǔ)性的技術(shù)保障。

參考文獻(xiàn)：

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[16]Honda K，Watanabe H，Tsutsui K. Cryopreservation of Delphinium pollen at -30 ℃[J]. Euphytica，2002，126（3）：315-320.endprint

2.3貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

貯藏前的大喇叭杜鵑花粉有較高的生命力，其花粉萌發(fā)率達(dá)91.7%，適宜授粉。從表1可以看出，在室溫、4 ℃、-18 ℃ 等3種貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率均降低，并且以室溫條件下的花粉萌發(fā)率下降得最快。室溫貯藏1個(gè)月后，花粉萌發(fā)率降低至581%，貯藏2個(gè)月后為37.6%，4個(gè)月后其花粉萌發(fā)率已降為46%，6個(gè)月時(shí)已降為0；4 ℃條件下，其花粉萌發(fā)率的降低速度相對(duì)緩慢，貯藏2個(gè)月后的花粉萌發(fā)率為68.7%，貯藏4、5個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為12.2%、21.3%，而6個(gè)月后則降至1.4%；-18 ℃下的花粉貯藏效果最好，貯藏1個(gè)月后的花粉萌發(fā)率與新鮮花粉相當(dāng)，達(dá)90.1%，至4個(gè)月時(shí)其萌發(fā)率依然大于60.0%，貯藏5、6個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為47.3%、15.0%。

3結(jié)論與討論

花粉是植物有性繁殖進(jìn)行遺傳物質(zhì)傳遞的載體，其活力直接影響傳遞的成敗。因此在進(jìn)行授粉之前，首先要對(duì)花粉的活力進(jìn)行檢測(cè)?；ǚ鄣纳盍σ蚱贩N而異，并且隨著外界的影響（溫度、濕度、輻射、貯藏條件）而變化。Wolukau等認(rèn)為，梅花花粉的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃[9]；Burke等認(rèn)為，棉花花粉的適宜的培養(yǎng)溫度為20～37 ℃[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)生長(zhǎng)有明顯影響，其花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，過(guò)高的培養(yǎng)溫度則會(huì)抑制花粉萌發(fā)。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，在pH值為4.0～6.0的條件下，大喇叭杜鵑花粉能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，且萌發(fā)率達(dá)到40%以上，最大萌發(fā)率為87%，當(dāng)pH值在3.5或6.0～7.5時(shí)，花粉就不能萌發(fā)，最適合大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的pH值為4.5。這與蘋果屬花粉、甜橙花粉等極不相同，蘋果屬、甜橙等植物的花粉在pH值為4.0～9.0之間都能夠正常萌發(fā)，甜橙花粉最適的pH值為6.0～7.0[11]；而七子花在pH值為5.5～8.0條件下均能萌發(fā)，最適 pH值為7，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件均不利于大部分植物離體花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，大喇叭杜鵑的花粉在強(qiáng)酸下最適合萌發(fā)，這與其實(shí)際的生長(zhǎng)環(huán)境極其相關(guān)。

影響花粉壽命的關(guān)鍵因素是花粉含水量和貯藏溫度，低溫、干燥處理是長(zhǎng)期保存花粉的必要條件[13-15]。有研究表明，將不同品種的飛燕草花粉干燥并貯藏在-30 ℃條件下，經(jīng)過(guò)180 d后仍然保持較高的萌發(fā)率和較長(zhǎng)的花粉管[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率逐漸下降；適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏有利于延長(zhǎng)大喇叭杜鵑花粉的壽命，貯藏在-18 ℃下的花粉經(jīng)過(guò)1個(gè)月后仍然保持90.1%的萌發(fā)率，與貯藏前花粉的萌發(fā)率（91.7%）相比僅僅下降了1.6百分點(diǎn)?？傮w看來(lái)，低溫保存是目前植物種質(zhì)資源保存中較理想的途徑，低溫貯藏的大喇叭杜鵑花粉可直接用于雜交育種中進(jìn)行授粉，從而為進(jìn)一步培育新品種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為將來(lái)用超低溫保存技術(shù)對(duì)其長(zhǎng)期保存作了基礎(chǔ)性的技術(shù)保障。

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[16]Honda K，Watanabe H，Tsutsui K. Cryopreservation of Delphinium pollen at -30 ℃[J]. Euphytica，2002，126（3）：315-320.endprint

2.3貯藏方式對(duì)大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的影響

貯藏前的大喇叭杜鵑花粉有較高的生命力，其花粉萌發(fā)率達(dá)91.7%，適宜授粉。從表1可以看出，在室溫、4 ℃、-18 ℃ 等3種貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率均降低，并且以室溫條件下的花粉萌發(fā)率下降得最快。室溫貯藏1個(gè)月后，花粉萌發(fā)率降低至581%，貯藏2個(gè)月后為37.6%，4個(gè)月后其花粉萌發(fā)率已降為46%，6個(gè)月時(shí)已降為0；4 ℃條件下，其花粉萌發(fā)率的降低速度相對(duì)緩慢，貯藏2個(gè)月后的花粉萌發(fā)率為68.7%，貯藏4、5個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為12.2%、21.3%，而6個(gè)月后則降至1.4%；-18 ℃下的花粉貯藏效果最好，貯藏1個(gè)月后的花粉萌發(fā)率與新鮮花粉相當(dāng)，達(dá)90.1%，至4個(gè)月時(shí)其萌發(fā)率依然大于60.0%，貯藏5、6個(gè)月后的花粉萌發(fā)率分別為47.3%、15.0%。

3結(jié)論與討論

花粉是植物有性繁殖進(jìn)行遺傳物質(zhì)傳遞的載體，其活力直接影響傳遞的成敗。因此在進(jìn)行授粉之前，首先要對(duì)花粉的活力進(jìn)行檢測(cè)?；ǚ鄣纳盍σ蚱贩N而異，并且隨著外界的影響（溫度、濕度、輻射、貯藏條件）而變化。Wolukau等認(rèn)為，梅花花粉的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃[9]；Burke等認(rèn)為，棉花花粉的適宜的培養(yǎng)溫度為20～37 ℃[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對(duì)大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)生長(zhǎng)有明顯影響，其花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，過(guò)高的培養(yǎng)溫度則會(huì)抑制花粉萌發(fā)。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，在pH值為4.0～6.0的條件下，大喇叭杜鵑花粉能正常萌發(fā)生長(zhǎng)，且萌發(fā)率達(dá)到40%以上，最大萌發(fā)率為87%，當(dāng)pH值在3.5或6.0～7.5時(shí)，花粉就不能萌發(fā)，最適合大喇叭杜鵑花粉萌發(fā)的pH值為4.5。這與蘋果屬花粉、甜橙花粉等極不相同，蘋果屬、甜橙等植物的花粉在pH值為4.0～9.0之間都能夠正常萌發(fā)，甜橙花粉最適的pH值為6.0～7.0[11]；而七子花在pH值為5.5～8.0條件下均能萌發(fā)，最適 pH值為7，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件均不利于大部分植物離體花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，大喇叭杜鵑的花粉在強(qiáng)酸下最適合萌發(fā)，這與其實(shí)際的生長(zhǎng)環(huán)境極其相關(guān)。

影響花粉壽命的關(guān)鍵因素是花粉含水量和貯藏溫度，低溫、干燥處理是長(zhǎng)期保存花粉的必要條件[13-15]。有研究表明，將不同品種的飛燕草花粉干燥并貯藏在-30 ℃條件下，經(jīng)過(guò)180 d后仍然保持較高的萌發(fā)率和較長(zhǎng)的花粉管[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，大喇叭杜鵑花粉的萌發(fā)率逐漸下降；適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏有利于延長(zhǎng)大喇叭杜鵑花粉的壽命，貯藏在-18 ℃下的花粉經(jīng)過(guò)1個(gè)月后仍然保持90.1%的萌發(fā)率，與貯藏前花粉的萌發(fā)率（91.7%）相比僅僅下降了1.6百分點(diǎn)?？傮w看來(lái)，低溫保存是目前植物種質(zhì)資源保存中較理想的途徑，低溫貯藏的大喇叭杜鵑花粉可直接用于雜交育種中進(jìn)行授粉，從而為進(jìn)一步培育新品種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為將來(lái)用超低溫保存技術(shù)對(duì)其長(zhǎng)期保存作了基礎(chǔ)性的技術(shù)保障。

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