劉志偉等

1引言

維?？怂梗╒X）、沙林（GB）作為神經(jīng)性毒劑，具有高效強(qiáng)毒、快速殺傷的特點(diǎn)。檢測VX和GB常用的方法有色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和波譜法等，這些方法的檢測靈敏度雖然很高，但樣品處理繁瑣，分析時(shí)間長、成本高，且所需儀器復(fù)雜、價(jià)格昂貴、龐大笨重，需要專業(yè)技術(shù)人員操作和維護(hù)，不適用于現(xiàn)場快速檢測＼[1～3＼]。目前含磷毒劑生物傳感器具有體積小、響應(yīng)靈敏、快速、一般不需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于毒劑的現(xiàn)場檢測中，但這類傳感器一般采用膽堿酯酶作為分子識別物質(zhì)，對所有能抑制膽堿酯酶活性的含磷毒劑和氨基甲酸酯均有響應(yīng)，無法區(qū)分毒劑種類＼[4＼]。

適配子（Aptamer）是人工合成的單鏈寡核苷酸，具有親和力高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好及制備容易等優(yōu)點(diǎn)，在生物傳感器中作為一種新的分子識別物質(zhì)正受到越來越多的重視[5，6]。壓阻式微懸臂梁將壓阻材料集成于微懸臂梁中，通過惠斯通電橋?qū)⑽冶哿旱膹澢苯愚D(zhuǎn)換為電壓信號進(jìn)行輸出＼[7＼]。由于壓阻式微懸臂梁讀出方式簡單、易于集成，成本低，體積小，在生化分子的現(xiàn)場檢測中具有很好的發(fā)展前景＼[8，9＼]。目前，有關(guān)微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB及動力學(xué)分析方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究的目的在于： （1）利用毒劑特異性的VX和GB適配子，建立一種基于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的新方法，實(shí)現(xiàn)對VX和GB的高靈敏特異性檢測，以解決現(xiàn)有含磷毒劑生物傳感器無法區(qū)分毒劑種類的缺陷； （2）創(chuàng)建壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的反應(yīng)動力學(xué)模型，為傳感器的數(shù)據(jù)處理、噪聲及非特異性信號干擾的排除提供理論依據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

壓阻式微懸臂梁檢測平臺由本室與北京大學(xué)微電子學(xué)研究院共同搭建（壓阻式微懸臂梁傳感芯片：長200 μm，寬50 μm，厚約1 μm）。VX和GB的甲醇儲備液、VX適配子（5′BioTCGCAAGACGGACAGAAGGTTTTTATTTTATCTTTGATTACTGTTTTTTTGTTTAGTTGTGTTGGTGGAGCGATTTGT3′）、GB適配子（5′BioTCGCAAGACGGACAGAAGTTGGGACTGCCACTTTGTGTTTTGGTTATAGTACTTATTTGCGTTGGTGGAGCGATTTGT3′）均由本實(shí)驗(yàn)室制備；活化生物素（BiotinNHS ester）、3，3，二巰基丙酸（DDPA）、1乙基3（3二甲氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、親和素（Avidin）、乙醇胺（Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA，上海國藥集團(tuán)有限公司）；PBS緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L）；其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1微懸臂梁適配子傳感器的構(gòu)建將芯片置于檢測池中，加入DDPA（5 g/L），反應(yīng)1 h，使芯片表面金膜包被上羧基；以水清洗芯片及檢測池，加入EDC（5 g/L）和NHS（5 g/L），反應(yīng)0.5 h，完成對微懸臂梁表面的羧基活化修飾；清洗芯片后自然晾干，滴加20 μL 100 mg/L 親和素，反應(yīng)0.5 h；清洗后滴加20 μL 1 mol/L 乙醇胺，反應(yīng)0.5 h以滅活金膜表面殘余的活化羧基；清洗后將芯片置于含PBS緩沖溶液的檢測池中，加入2 μmol/L生物素化的VX和GB適配子，反應(yīng)2 h，清洗芯片及檢測池。

2.2.2VX和GB的檢測將構(gòu)建好的傳感芯片置于含0.01 mol/L PBS緩沖溶液的檢測池中，待信號穩(wěn)定后，加入不同濃度的VX或GB（一個(gè)芯片測量一個(gè)濃度），記錄傳感器的響應(yīng)電壓。另以0.01 mol/L PBS及200 μg/L O丁基甲基膦酰氯作為對照，考察傳感器的特異性。

2.2.3微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB毒劑動力學(xué)模型的建立與分析

根據(jù)配體、受體結(jié)合的假一級動力學(xué)方程與壓阻式微懸臂梁輸出電壓變化和受力關(guān)系的特性，推導(dǎo)出壓阻式微懸臂梁適配子傳感器輸出電壓變化與時(shí)間之間的動力學(xué)模型。根據(jù)建立的動力學(xué)模型對VX和GB的實(shí)際檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，由擬合方程求出傳感器對不同濃度VX和GB反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的響應(yīng)電壓（ΔUe）及響應(yīng)時(shí)間（t0），分析模擬值與實(shí)測值之間的關(guān)系。

2.2.4VX和GB典型模擬樣品的測定

3結(jié)果與討論

3.1微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB

利用構(gòu)建好的微懸壁梁適配子傳感器對不同濃度的VX和GB進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。

當(dāng)VX濃度為60， 30和20 μg/L時(shí)，傳感器響應(yīng)信號（輸出電壓變化）分別為55.8， 21.5和12.5 μV； 當(dāng)VX的濃度進(jìn)一步降至4和2 μg/L時(shí)，傳感器響應(yīng)信號為4.5和3.1 μV，再進(jìn)一步降低VX濃度至1 μg/L時(shí)，基本接近噪音信號（約1 μV），因此確定傳感器對VX的檢出限為2 μg/L（S/N≥3）。在2～60 μg/L濃度范圍內(nèi)， 微懸臂梁傳感器響應(yīng)信號（輸出電壓變化，ΔUe）隨VX濃度（C）增加而增大，呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為ΔUe=0.886C-1.039（n=5，R=0.984， p<0.001）。

以相同方法對GB進(jìn)行檢測，確定傳感器對GB的檢出限為10 μg/L（S/N≥3）。在10～60 μg/L濃度范圍內(nèi)，微懸臂梁傳感器響應(yīng)信號與GB濃度呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為ΔUe=0.716C-2.304（n=5， R=0.996， p<0.001）。

對照實(shí)驗(yàn)表明，加入0.01 mol/L PBS作為空白對照及與VX和GB結(jié)構(gòu)非常相似的O丁基甲基膦酰氯（200 μg/L）作為干擾時(shí)，傳感器基本無響應(yīng)，表明傳感器具有很好的特異性與抗干擾能力。對20 μg/L VX重復(fù)3次測定，傳感器響應(yīng)信號ΔUe值為（13.7±1.08）μV，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.9%。對10 μg/LGB重復(fù)3次測定，傳感器響應(yīng)信號ΔUe值為（5.0±0.35） μV，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.0%，傳感器重現(xiàn)性較好。

根據(jù)建立的理論模型，對檢測VX和GB的實(shí)際結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析，結(jié)果見圖2、表1和表2。 從表1和表2可知，建立的壓阻式微懸臂梁適配子傳感器ΔU隨t變化的動力學(xué)模型（方程2）能很好地與不同濃度VX和GB的實(shí)測數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)R>0.8536（p<0.01），且隨著VX和GB濃度的增加，相關(guān)系數(shù)R呈現(xiàn)出不斷增大的趨勢，其值在檢出限附近較低，可能是由于干擾信號對其影響較大所致；根據(jù)擬合方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應(yīng)達(dá)到平衡的響應(yīng)電壓（ΔUe）、響應(yīng)時(shí)間（t0）均與實(shí)測值非常接近，且隨著VX和GB濃度的增加，傳感器響應(yīng)時(shí)間縮短，平衡響應(yīng)電壓增大，與實(shí)際情況具有很好的一致性，表明壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB遵循方程（2）建立的動力學(xué)模型。因此，該模型可用于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測生化分子的實(shí)際檢測數(shù)據(jù)分析，對出現(xiàn)的噪聲及非特異性信號進(jìn)行判別，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數(shù)據(jù)處理中去除噪聲及非特異性

4結(jié)論

利用適配子的高特異性及親和活性，以壓阻式微懸臂梁傳感器為檢測平臺，建立了一種基于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB及動力學(xué)分析的新方法，克服了傳統(tǒng)膽堿酯酶含磷毒劑生物傳感器無法區(qū)分毒劑種類的缺陷。此傳感器對VX和GB檢測的線性范圍分別為2～60 μg/L和10～60 μg/L，檢出限分別2和10 μg/L。傳感器對毒劑類似物O丁基甲基膦酰氯（200 μg/L）基本無響應(yīng)，具有很好的特異性和抗干擾能力，能夠滿足土壤、蔬菜、環(huán)境水樣等典型模擬樣品的檢測要求。在此基礎(chǔ)上，建立了壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的反應(yīng)動力學(xué)模型，此模型能很好地反映傳感器檢測VX和GB的動力學(xué)過程。根據(jù)擬合模型方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應(yīng)達(dá)到平衡的響應(yīng)電壓（ΔUe）、響應(yīng)時(shí)間（t0）均與實(shí)測值非常接近。此模型可用于實(shí)際檢測數(shù)據(jù)的分析，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數(shù)據(jù)處理中去除噪聲及非特異性信號的干擾提供了理論依據(jù)。此傳感器操作簡單、響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好，不需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，在神經(jīng)性毒劑現(xiàn)場快速檢測方面具有較好應(yīng)用前景。

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12LIU ZhiWei， TONG ZhaoYang， MU XiHui， LIU Bing， HAO LanQun， ZHANG JinPing. Transducer and Microsystem Technologies， 2014， 33（3）： 8-11

劉志偉， 童朝陽， 穆晞惠， 劉 冰， 郝蘭群， 張金平. 傳感器與微系統(tǒng)， 2014， 33（3）： 8-11

AbstractA new method for Oethyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate （VX）， sarin detection and its kinetic analysis based on piezoresistive microcantilever aptasensor was developed， where VX， sarin aptamers were immobilized on the microcantilever surface by biotinavidin binding system. A linear relationship between the response voltage and the concentration of VX in the range of 2-60μg/L was obtained. The linear regression equation was ΔUe=0.886C-1.039 （n=5， R=0.984， p<0.001） and the detection limit was 2 μg/L （S/N≥3）. A linear relationship between the response voltage and the concentration of sarin in the range of 10-60 μg/L was obtained， the linear regression equation was ΔUe=0.716C-2.304 （n=5， R=0.996， p<0.001） and the detection limit was 10 μg/L （S/N≥3）. The sensor showed no response for Obutyl methylphosphonochloridate， a structural analog of VX and sarin， which indicated high specificity and good antiinterference ability. On this basis， a reaction kinetic model based on receptorligand binding and the relationship with output voltage change was established. Response voltage （ΔUe） and response time（t0） were obtained from the fitting equation on different concentrations of VX， sarin fitted well with the measured values.

KeywordsMicrocantilever； Aptasensor； OEthyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate； Sarin； Kinetic analysis

根據(jù)建立的理論模型，對檢測VX和GB的實(shí)際結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析，結(jié)果見圖2、表1和表2。 從表1和表2可知，建立的壓阻式微懸臂梁適配子傳感器ΔU隨t變化的動力學(xué)模型（方程2）能很好地與不同濃度VX和GB的實(shí)測數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)R>0.8536（p<0.01），且隨著VX和GB濃度的增加，相關(guān)系數(shù)R呈現(xiàn)出不斷增大的趨勢，其值在檢出限附近較低，可能是由于干擾信號對其影響較大所致；根據(jù)擬合方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應(yīng)達(dá)到平衡的響應(yīng)電壓（ΔUe）、響應(yīng)時(shí)間（t0）均與實(shí)測值非常接近，且隨著VX和GB濃度的增加，傳感器響應(yīng)時(shí)間縮短，平衡響應(yīng)電壓增大，與實(shí)際情況具有很好的一致性，表明壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB遵循方程（2）建立的動力學(xué)模型。因此，該模型可用于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測生化分子的實(shí)際檢測數(shù)據(jù)分析，對出現(xiàn)的噪聲及非特異性信號進(jìn)行判別，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數(shù)據(jù)處理中去除噪聲及非特異性

4結(jié)論

利用適配子的高特異性及親和活性，以壓阻式微懸臂梁傳感器為檢測平臺，建立了一種基于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB及動力學(xué)分析的新方法，克服了傳統(tǒng)膽堿酯酶含磷毒劑生物傳感器無法區(qū)分毒劑種類的缺陷。此傳感器對VX和GB檢測的線性范圍分別為2～60 μg/L和10～60 μg/L，檢出限分別2和10 μg/L。傳感器對毒劑類似物O丁基甲基膦酰氯（200 μg/L）基本無響應(yīng)，具有很好的特異性和抗干擾能力，能夠滿足土壤、蔬菜、環(huán)境水樣等典型模擬樣品的檢測要求。在此基礎(chǔ)上，建立了壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的反應(yīng)動力學(xué)模型，此模型能很好地反映傳感器檢測VX和GB的動力學(xué)過程。根據(jù)擬合模型方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應(yīng)達(dá)到平衡的響應(yīng)電壓（ΔUe）、響應(yīng)時(shí)間（t0）均與實(shí)測值非常接近。此模型可用于實(shí)際檢測數(shù)據(jù)的分析，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數(shù)據(jù)處理中去除噪聲及非特異性信號的干擾提供了理論依據(jù)。此傳感器操作簡單、響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好，不需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，在神經(jīng)性毒劑現(xiàn)場快速檢測方面具有較好應(yīng)用前景。

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劉志偉， 童朝陽， 穆晞惠， 劉 冰， 郝蘭群， 張金平. 傳感器與微系統(tǒng)， 2014， 33（3）： 8-11

AbstractA new method for Oethyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate （VX）， sarin detection and its kinetic analysis based on piezoresistive microcantilever aptasensor was developed， where VX， sarin aptamers were immobilized on the microcantilever surface by biotinavidin binding system. A linear relationship between the response voltage and the concentration of VX in the range of 2-60μg/L was obtained. The linear regression equation was ΔUe=0.886C-1.039 （n=5， R=0.984， p<0.001） and the detection limit was 2 μg/L （S/N≥3）. A linear relationship between the response voltage and the concentration of sarin in the range of 10-60 μg/L was obtained， the linear regression equation was ΔUe=0.716C-2.304 （n=5， R=0.996， p<0.001） and the detection limit was 10 μg/L （S/N≥3）. The sensor showed no response for Obutyl methylphosphonochloridate， a structural analog of VX and sarin， which indicated high specificity and good antiinterference ability. On this basis， a reaction kinetic model based on receptorligand binding and the relationship with output voltage change was established. Response voltage （ΔUe） and response time（t0） were obtained from the fitting equation on different concentrations of VX， sarin fitted well with the measured values.

KeywordsMicrocantilever； Aptasensor； OEthyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate； Sarin； Kinetic analysis

根據(jù)建立的理論模型，對檢測VX和GB的實(shí)際結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析，結(jié)果見圖2、表1和表2。 從表1和表2可知，建立的壓阻式微懸臂梁適配子傳感器ΔU隨t變化的動力學(xué)模型（方程2）能很好地與不同濃度VX和GB的實(shí)測數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)R>0.8536（p<0.01），且隨著VX和GB濃度的增加，相關(guān)系數(shù)R呈現(xiàn)出不斷增大的趨勢，其值在檢出限附近較低，可能是由于干擾信號對其影響較大所致；根據(jù)擬合方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應(yīng)達(dá)到平衡的響應(yīng)電壓（ΔUe）、響應(yīng)時(shí)間（t0）均與實(shí)測值非常接近，且隨著VX和GB濃度的增加，傳感器響應(yīng)時(shí)間縮短，平衡響應(yīng)電壓增大，與實(shí)際情況具有很好的一致性，表明壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB遵循方程（2）建立的動力學(xué)模型。因此，該模型可用于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測生化分子的實(shí)際檢測數(shù)據(jù)分析，對出現(xiàn)的噪聲及非特異性信號進(jìn)行判別，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數(shù)據(jù)處理中去除噪聲及非特異性

4結(jié)論

利用適配子的高特異性及親和活性，以壓阻式微懸臂梁傳感器為檢測平臺，建立了一種基于壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB及動力學(xué)分析的新方法，克服了傳統(tǒng)膽堿酯酶含磷毒劑生物傳感器無法區(qū)分毒劑種類的缺陷。此傳感器對VX和GB檢測的線性范圍分別為2～60 μg/L和10～60 μg/L，檢出限分別2和10 μg/L。傳感器對毒劑類似物O丁基甲基膦酰氯（200 μg/L）基本無響應(yīng)，具有很好的特異性和抗干擾能力，能夠滿足土壤、蔬菜、環(huán)境水樣等典型模擬樣品的檢測要求。在此基礎(chǔ)上，建立了壓阻式微懸臂梁適配子傳感器檢測VX和GB的反應(yīng)動力學(xué)模型，此模型能很好地反映傳感器檢測VX和GB的動力學(xué)過程。根據(jù)擬合模型方程求出的傳感器對不同濃度VX和GB反應(yīng)達(dá)到平衡的響應(yīng)電壓（ΔUe）、響應(yīng)時(shí)間（t0）均與實(shí)測值非常接近。此模型可用于實(shí)際檢測數(shù)據(jù)的分析，為解決壓阻式微懸臂梁傳感器數(shù)據(jù)處理中去除噪聲及非特異性信號的干擾提供了理論依據(jù)。此傳感器操作簡單、響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好，不需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，在神經(jīng)性毒劑現(xiàn)場快速檢測方面具有較好應(yīng)用前景。

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AbstractA new method for Oethyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate （VX）， sarin detection and its kinetic analysis based on piezoresistive microcantilever aptasensor was developed， where VX， sarin aptamers were immobilized on the microcantilever surface by biotinavidin binding system. A linear relationship between the response voltage and the concentration of VX in the range of 2-60μg/L was obtained. The linear regression equation was ΔUe=0.886C-1.039 （n=5， R=0.984， p<0.001） and the detection limit was 2 μg/L （S/N≥3）. A linear relationship between the response voltage and the concentration of sarin in the range of 10-60 μg/L was obtained， the linear regression equation was ΔUe=0.716C-2.304 （n=5， R=0.996， p<0.001） and the detection limit was 10 μg/L （S/N≥3）. The sensor showed no response for Obutyl methylphosphonochloridate， a structural analog of VX and sarin， which indicated high specificity and good antiinterference ability. On this basis， a reaction kinetic model based on receptorligand binding and the relationship with output voltage change was established. Response voltage （ΔUe） and response time（t0） were obtained from the fitting equation on different concentrations of VX， sarin fitted well with the measured values.

KeywordsMicrocantilever； Aptasensor； OEthyl S＼[2（diisopropylamino） ethyl＼] methylphosphonothiolate； Sarin； Kinetic analysis