向東山等

摘要利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)及核酸染料Hoechst 33258建立了一種高靈敏、高選擇性的特定序列核酸檢測(cè)方法，并以野生型乙型肝炎病毒的一段寡核苷酸序列為目標(biāo)DNA，對(duì)這種方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1引言

特定序列單鏈核酸（DNA）的特異性檢測(cè)在臨床診斷、基因治療、環(huán)境調(diào)查、食品安全及生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域都具有十分重要的意義＼[1～5＼]。分子信標(biāo)（Molecular beacons）是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，具有操作簡(jiǎn)單、選擇性好以及不必與未反應(yīng)的探針分離即可實(shí)時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)，在特定序列單鏈DNA的檢測(cè)中扮演著越來越重要的角色＼[6～13＼]。近年來，有關(guān)分子信標(biāo)對(duì)特定序列單鏈DNA檢測(cè)的報(bào)道逐漸增多＼[14～16＼]。盡管分子信標(biāo)在DNA的定性及定量分析中顯示出廣闊的應(yīng)用前景，但經(jīng)典分子信標(biāo)在實(shí)際定量分析中還存在一些不足： （1） 經(jīng)典分子信標(biāo)具有較強(qiáng)的背景信號(hào)，影響定量檢測(cè)的檢出限＼[17＼]；（2） 相對(duì)于核酸染料而言，分子信標(biāo)對(duì)核酸檢測(cè)的靈敏度較低；（3） 經(jīng)典分子信標(biāo)需要在兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)及猝滅基團(tuán)，制備時(shí)間長(zhǎng)且成本高。

核酸染料Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，具有很高的靈敏度＼[18，19＼]。它在水溶液中熒光很弱，與單鏈DNA幾乎不發(fā)生作用，但與雙鏈DNA具有很強(qiáng)的親和性，能嵌入雙鏈DNA的小溝中，與雙鏈中的A/T堿基對(duì)發(fā)生特異性結(jié)合，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度大大增加＼[20，21＼]。根據(jù)此原理，Hoechst 33258在雙鏈 DNA 含量測(cè)定中，已得到廣泛應(yīng)用＼[22，23＼]。

Hoechst 33258 與分子信標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的報(bào)道較少。James等＼[24＼]利用Hoechst 33258 與分子信標(biāo)研究了發(fā)夾聚酰胺對(duì)雙鏈DNA的解鏈溫度的影響，并獲得了較好的結(jié)果。到目前為止，利用Hoechst 33258 結(jié)合分子信標(biāo)對(duì)特定序列核酸的檢測(cè)還未見報(bào)道。

本研究利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)（無有機(jī)熒光基團(tuán)和熒滅基團(tuán)）及Hoechst 33258建立一種高靈敏、高選擇性的特定序列核酸檢測(cè)方法。在這種分析方法中，將無標(biāo)記分子信標(biāo)的莖完全設(shè)計(jì)成C/G堿基對(duì)，分子信標(biāo)的環(huán)設(shè)計(jì)為目標(biāo)DNA的互補(bǔ)序列。利用分子信標(biāo)與目標(biāo)DNA反應(yīng)之前，Hoechst 33258熒光信號(hào)很弱，而與目標(biāo)DNA反應(yīng)之后，其熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)的基本原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定序列DNA的定量檢測(cè)。

相對(duì)于經(jīng)典分子信標(biāo)對(duì)核酸的檢測(cè)而言，本方法具有以下特點(diǎn)：（1）使用無標(biāo)記分子信標(biāo)，省去了標(biāo)記步驟， 降低了分析成本； （2）將分子信標(biāo)的莖完全設(shè)計(jì)成C/G堿基對(duì)，而Hoechst 33258不與C/G堿基對(duì)發(fā)生作用，因此背景熒光很低，可顯著降低分析方法的檢出限； （3）利用Hoechst 33258的熒光代替經(jīng)典分子信標(biāo)中的熒光基團(tuán)對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行檢測(cè)，可顯著提高檢測(cè)的靈敏度。這主要是因?yàn)槔煤怂崛玖蠙z測(cè)核酸時(shí)，一個(gè)核酸分子能與多個(gè)核酸染料相結(jié)合，而每個(gè)分子信標(biāo)只有一個(gè)熒光基團(tuán)。同時(shí)無標(biāo)記的分子信標(biāo)又保留了經(jīng)典分子信標(biāo)中莖環(huán)的結(jié)構(gòu)，仍然具有很高的選擇性。

3結(jié)果與討論

3.1檢測(cè)原理

利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)及Hoechst 33258對(duì)特定序列核酸檢測(cè)的原理如圖1所示。在沒有目標(biāo)DNA時(shí)，盡管分子信標(biāo)處于莖環(huán)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但分子信標(biāo)的莖全部由C/G堿基對(duì)組成，不與Hoechst 33258作用，此時(shí)Hoechst 33258的熒光信號(hào)很弱；在有目標(biāo)DNA時(shí)，其與分子信標(biāo)發(fā)生雜交反應(yīng)，形成雙鏈DNA后再與Hoechst 33258結(jié)合，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。根據(jù)熒光增強(qiáng)的程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定單鏈DNA的檢測(cè)。

3.3.6核酸染料Hoechst 33258與雙鏈DNA作用的時(shí)間的影響核酸染料Hoechst 33258只有與雙鏈DNA結(jié)合之后才會(huì)發(fā)出較強(qiáng)的熒光，因此它與雙鏈DNA的結(jié)合時(shí)間是影響其熒光強(qiáng)度的重要因素。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Hoechst 33258與雙鏈DNA的結(jié)合時(shí)間進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在9 min內(nèi)，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而增大；當(dāng)結(jié)合時(shí)間超過9 min后，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化。

3.4工作曲線及復(fù)雜樣品中核酸的檢測(cè)

在3.5堿基錯(cuò)配分析

對(duì)不同堿基錯(cuò)配序列DNA進(jìn)行了分析，以考察方法的特異性，結(jié)果如圖4所示。對(duì)于不同堿基錯(cuò)配序列的DNA，Hoechst 33258的熒光強(qiáng)度具有顯著區(qū)別。對(duì)于目標(biāo)DNA序列、單堿基錯(cuò)配DNA序列、雙堿基錯(cuò)配DNA序列及三堿基錯(cuò)配DNA序列，所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度之比

4結(jié)論

利用無標(biāo)記的分子信標(biāo)與單鏈DNA特異性反應(yīng)生成雙鏈，再與Hoechst 33258結(jié)合后，其熒光顯著增強(qiáng)的基本原理，建立了檢測(cè)特定序列核酸的新方法。本方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢出限低。

References

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AbstractA highly sensitive and selective method for specific DNA sequence detection is developed using a nonlabeled molecular beacon （MB） and a nucleic acid dye Hoechst 33258. It is demonstrated by a specific DNA sequence of wildtype HBV as a model system. In this strategy， the stem of MB is completely designed as C/G base pairs. In the absence of target DNA， the interaction between Hoechst 33258 and the MBs is very weak，and the fluorescence signals of Hoechst 33258 is very low. In the presence of target DNA， the MBs hybridize with the target DNA and form doublestranded structure. Hoechst 33258 binds to dsDNA， and the fluorescence intensity is significantly enhanced. Under the optimum conditions， the fluorescence intensity of Hoechst 33258 exhibits good linear dependence on target DNA concentration in the range of 2×10

The proposed method has good precision， simple operation， fast detection speed， low detection limit， high accuracy and high sensitivity.

KeywordsNonlabeled molecular beacon； Hoechst 33258 nucleic acid dye； Singlestranded nucleic acid； Fluorescence

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AbstractA highly sensitive and selective method for specific DNA sequence detection is developed using a nonlabeled molecular beacon （MB） and a nucleic acid dye Hoechst 33258. It is demonstrated by a specific DNA sequence of wildtype HBV as a model system. In this strategy， the stem of MB is completely designed as C/G base pairs. In the absence of target DNA， the interaction between Hoechst 33258 and the MBs is very weak，and the fluorescence signals of Hoechst 33258 is very low. In the presence of target DNA， the MBs hybridize with the target DNA and form doublestranded structure. Hoechst 33258 binds to dsDNA， and the fluorescence intensity is significantly enhanced. Under the optimum conditions， the fluorescence intensity of Hoechst 33258 exhibits good linear dependence on target DNA concentration in the range of 2×10

The proposed method has good precision， simple operation， fast detection speed， low detection limit， high accuracy and high sensitivity.

KeywordsNonlabeled molecular beacon； Hoechst 33258 nucleic acid dye； Singlestranded nucleic acid； Fluorescence

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The proposed method has good precision， simple operation， fast detection speed， low detection limit， high accuracy and high sensitivity.

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