夏建海，范武江，王曉清，馬 曉，戴振炎，王璐明

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，中國 長沙 410128；2.上海市水產(chǎn)研究所，中國 上海 200433)

3個不同地理日本沼蝦天然群體遺傳多樣性的SSR分析

夏建海1，范武江2*，王曉清1*，馬 曉1，戴振炎1，王璐明1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，中國 長沙 410128；2.上海市水產(chǎn)研究所，中國 上海 200433)

利用11對微衛(wèi)星引物對洞庭湖、鄱陽湖、龍感湖的日本沼蝦天然群體進行遺傳多樣性的分析，評價不同地理日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性和遺傳分化水平．在3個日本沼蝦群體中共獲得90個等位基因，各位點平均等位基因為8.182個，各群體的平均等位基因數(shù)在(A)32～38之間，平均多態(tài)信息含量(PIC)介于0.590 7～0.643 0，平均期望雜合度He為0.657 7～0.705 5、平均觀測雜合度Ho為0.514 1～0.579 9．群體間各位點Shannon指數(shù)均大于1，F(xiàn)is均為正值，群體間平均近交系數(shù)為19%，F(xiàn)st值顯示整個群體分化程度較低，其中遺傳變異的5.38%存在于群體之間，94.62%存在于個體之間．結(jié)果表明：3個日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性較高，分化程度較低，其中鄱陽湖群體遺傳多樣性最豐富，遺傳分化水平最低．

日本沼蝦；微衛(wèi)星；遺傳多樣性；遺傳分化

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)俗稱青蝦、河蝦，隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)[1-2]．湖南洞庭湖、江西鄱陽湖、湖北龍感湖是我國日本沼蝦天然資源較豐富的分布區(qū)和產(chǎn)區(qū)[3-4]．近年來，日本沼蝦由于營養(yǎng)豐富、口味鮮美、市場價值較高而得到廣泛養(yǎng)殖[5-6]．國內(nèi)外有關(guān)日本沼蝦遺傳多樣性的研究，已報道的有采用線粒體16SrRNA序列片段變異和COI方法分析長江和五大淡水湖天然日本沼蝦群體遺傳多樣性[7-8]，采用RAPD[9]和AFLP[10]方法分析長江、龍港湖、太湖等天然日本沼蝦群體遺傳多樣性，使用線粒體COI序列分析我國九大水系、五大淡水湖及長江中下游流域日本沼蝦種質(zhì)資源遺傳多樣性和系統(tǒng)進化[11-12]，以及采用微衛(wèi)星標(biāo)記研究太湖、洪澤湖、錢塘江天然日本沼蝦遺傳多樣性[13-15]．本研究采用SSR標(biāo)記技術(shù)分析我國洞庭湖、鄱陽湖、龍感湖日本沼蝦群體的遺傳多樣性，探討三大湖泊日本沼蝦群體的遺傳結(jié)構(gòu)和群體分化水平，以期為保護我國天然日本沼蝦種質(zhì)資源及合理開發(fā)利用提供更科學(xué)的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 樣本的采集及DNA提取

2011年12月分別對湖南洞庭湖(DT)、江西鄱陽湖(PY) 、湖北龍感湖(LG)3個天然日本沼蝦群體進行采樣，具體采樣地點如表1所示．每個群體采樣29尾,剪取尾部肌肉用無水乙醇固定后帶回實驗室，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫蚪MDNA的提取參照目前通用的柱式肌肉試劑盒(天恩澤試劑公司)方法操作，并檢測其濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

表1 日本沼蝦樣本采集地

1.2 微衛(wèi)星引物的篩選及擴增

從相關(guān)文獻和GenBank庫中搜索青蝦微衛(wèi)星序列，設(shè)計了47對引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成．首先用2個樣本篩選引物，并摸索PCR條件．反應(yīng)體系：PCR MagicMIX 7.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, DNA模板0.5 μL，ddH2O 6.0 μL．PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min，94 ℃ 30 s,退火30 s,72 ℃延伸1 min，經(jīng)過26個循環(huán)，72 ℃延伸10 min,4 ℃保存．各引物的退火溫度見表2．PCR產(chǎn)物經(jīng)1%(質(zhì)量分數(shù)，下同)的瓊脂糖電泳檢測合格后，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用pBR322DNA/MspI作為相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，銀染后拍照分析．

1.3 數(shù)據(jù)處理

參照Marker大小對所擴增條帶估算相對分子質(zhì)量，確定其基因型，并利用GENEPOP1.32軟件進行數(shù)據(jù)分析，分別計算等位基因數(shù)、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)、遺傳分化，用PIC-CALC軟件對各微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量進行計算．

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選與擴增圖譜

選取11對微衛(wèi)星引物進行PCR擴增，在3個群體中均獲得較好的擴增結(jié)果，圖1為引物Mn11擴增圖譜．11對引物共獲得90個等位基因，各位點出現(xiàn)等位基因3～13個不等，平均獲得8.182個等位基因，其中Mn 24位點獲得等位基因最多為13個，其次Mn 5和Mn 37位點為11個，Mn3位點獲得位點最少為3個．

圖1 DT、LG、PY日本沼蝦天然群體Mn11位點的微衛(wèi)星檢測圖譜Fig.1 Demonstration of microsatellite locus amplified by Mn11 primer pairs in three different wild macrobrachium nipponense populations

表2 日本沼蝦微衛(wèi)星引物序列及退火溫度

2.2 各群體遺傳多樣性分析

11個微衛(wèi)星位點在3個群體中的遺傳多樣性參數(shù)見表3，通過每個微衛(wèi)星位點的基因頻率計算出每個位點在群體中的平均多態(tài)信息含量(PIC)介于0.454 7～0.750 4，其中Mn27位點所含多態(tài)信息含量最高為0.750 4，Mn3位點多態(tài)信息含量最低為0.454 7，其余基因位點PIC值均在0.5以上，這表明各位點均為較高多態(tài)位點，方可有效進行后續(xù)分析．3個群體在11個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)見表4，其平均有效等位基因介于3.191 9～3.458 2，平均期望雜合度、觀測雜合度和平均多態(tài)信息含量鄱陽湖最高分別為0.705 5、0.579 9、0.643 0．這表明3個群體中鄱陽湖的遺傳多樣性最高．

表3 11個微衛(wèi)星位點有效等位位點數(shù)、雜合度及多態(tài)信息含量

表4 3個群體在11個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性

2.3 微衛(wèi)星位點Hard-Weiberg平衡分析

經(jīng)卡方檢驗各位點在群體中的Hard-Weiberg平衡檢驗P值(表5)，發(fā)現(xiàn)鄱陽湖、龍感湖均有4個位點顯著偏離Hard-Weiberg平衡，其中洞庭湖最多，有5個位點顯著偏離Hard-Weiberg平衡，1個發(fā)生平衡偏離．

表5 日本沼蝦3個天然群體11個群體位點的有效等位基因數(shù)、雜合度值及P檢驗值

注：*P<0.05，**P<0.01.

2.4 群體遺傳變異分析

表6顯示11個位點中Mn3的Shannon指數(shù)較低，說明其遺傳變異程度較低，其余位點的變異程度較高，3個群體遺傳變異程度由高到低依次為鄱陽湖、洞庭湖、龍感湖．表7中各位點的F-統(tǒng)計量參數(shù)顯示，F(xiàn)is均為正值，群體間平均近交系數(shù)為19%，F(xiàn)st值介于0.017 6～0.151 5之間，屬于中等分化(0.054,反映群體間的基因流通暢．

表6 3個日本沼蝦種群的11個微衛(wèi)星座位的Shannon指數(shù)

表7 3個日本沼蝦種群15個微衛(wèi)星座位的F-統(tǒng)計量

3 討論

3.1 3個地理日本沼蝦天然群體的遺傳多樣性

本研究利用篩選出的11對微衛(wèi)星引物對洞庭湖、龍感湖和鄱陽湖3個日本沼蝦群體的遺傳多樣性分析表明，其多態(tài)信息含量PIC介于0.454 7～0.750 4之間．根據(jù)高度多態(tài)性信息含量衡量標(biāo)準(zhǔn)，PIC>0.5[16]，除Mn3位點處于中度多態(tài)位點，其余均屬于高度多態(tài)性位點．從龍感湖、洞庭湖、鄱陽湖實驗數(shù)據(jù)依次來看，平均等位基因數(shù)為32、35、38，平均多態(tài)信息含量(PIC)0.5907、0.6115、0.6430，平均期望雜合度(He)0.657 7、0.679 8、0.705 5，比洪澤湖日本沼蝦(He=0.698～0.804)[14]、錢塘江日本沼蝦(He=0.83～0.88)[15]和太湖日本沼蝦(He=0.893 7～0.934 4)[13]的平均期望雜合度低，與楊頻[17]等對鄱陽湖日本沼蝦群體遺傳多樣性分析的結(jié)果有較大差異，其主要原因是湖泊面積較大，采樣范圍和數(shù)量較少導(dǎo)致．研究表明洞庭湖、龍感湖和鄱陽湖3個日本沼蝦群體的遺傳多樣性較高，其中鄱陽湖遺傳多樣性最為豐富，龍感湖遺傳多樣性最低，與蔣速飛等[9]、馮建彬等[18]對我國各大湖泊日本沼蝦群體遺傳多樣性的結(jié)論相似．根據(jù)Shannon多樣性指數(shù)，鄱陽湖、洞庭湖，龍感湖的遺傳變異程度依次為1.316 8，1.262 3,1.210 1，進一步說明鄱陽湖群體的遺傳多樣性最為豐富，這可能與鄱陽湖域的水文環(huán)境變化大有密切的關(guān)系．

3.2 日本沼蝦群體內(nèi)的Hardy-Weinberg平衡狀況

利用Hardy-Weinberg平衡定律對每個位點平衡狀態(tài)的分析結(jié)果(表4)表明，每個群體中均有4個位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，顯現(xiàn)雜合不足，說明這3個群體多數(shù)微衛(wèi)星位點偏離Hardy-Weinberg平衡，據(jù)Hardy-Weinberg平衡基本條件，足夠大的群體交配隨機，未出現(xiàn)選擇、遷移、突變和遺傳漂變等現(xiàn)象[19]，偏離平衡的原因主要在于日本沼蝦自身的特點和生活習(xí)慣，并受其水域環(huán)境的影響，也反映了由于內(nèi)陸湖泊長期與江湖阻隔以及生境條件的不同, 導(dǎo)致群體內(nèi)遺傳分化較嚴重．另一個原因是長年受人們捕撈過度的影響導(dǎo)致群體內(nèi)自交現(xiàn)象比較嚴重[13]，從而使得這3個群體日本沼蝦偏離Hardy-Weinberg平衡．因此，除了自然因素的制約，人為因素也會加快日本沼蝦天然遺傳資源的稀釋和衰退速度，進一步導(dǎo)致種質(zhì)退化和優(yōu)良性狀的喪失．

3.3 3個日本沼蝦群體間遺傳分化分析

Fst值和基因流是衡量群體間的遺傳分化程度的主要指標(biāo)，本實驗得出各位點的F-統(tǒng)計量參數(shù)顯示，F(xiàn)is均為正值，群體間平均近交系數(shù)為19%，F(xiàn)st值介于0.017 6～0.151 5，屬于中等偏低分化(0.05

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(編輯 王 健)

Genetic Diversity in Three Different Natural Populations ofMacrobrachiumnipponenseRevealed by SSR Markers

XIAJian-hai1,FANWu-jiang2*,WANGXiao-qing1*,MAXiao1,DAIZhen-yan1,WANGLu-ming1

(1.College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai 200433, China)

To evaluate the genetic diversity and genetic differentiation of the different natural populations ofMacrobrachiumnipponense, 11 microsatellite locus were used to analyze the genetic diversity in three natural populations ofMacrobrachiumnipponenseDongting, Poyang and Longgan. The results showed that 11 microsatellite locus were highly polymorphic. A total of 90 alleles were detected, each loci had 8.182 alleles. In these natural populations the average number of allele (A ) ranged from 32 to 38, and the value of average polymorphism information content ( PIC ) was 0.590 7 to 0.643 0, the value of average expected heterozygosityHewas 0. 657 7 to 0.705 5, the value of average observed heterozygosityHoin three populations ranged from 0.514 1 to 0.579 9. Shannon indexes were greater than 1.Fiswere positive, average inbreeding coefficient of populations was 19%.FstValues show that the whole populational differentiation degree was lower. Most variation occurred within populations (94.62) among population (5.38). The results showed that the genetic diversity is richer in three natural populations ofMacrobrachiumnipponense, and Poyang is the most abundant in genetic diversity population and the lowest level of genetic differentiation.

Macrobrachiumnipponense; microsatellite; genetic diversity; genetic differentiation

2013-04-15

上海市農(nóng)業(yè)委員會資助項目(滬農(nóng)科推字(2011)第6-1號)

*

,E-mail：wangxiao8258@126.com； fanwujiang@126.com

S917

A

1000-2537(2014)04-0023-06