孫 璐，遲德富*，宇 佳，關(guān)樺楠

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，中國(guó)哈爾濱 150040;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，中國(guó) 哈爾濱 150076)

近年來(lái)重金屬中毒的事件頻繁發(fā)生，重金屬離子檢測(cè)顯得越來(lái)越重要.檢測(cè)重金屬離子的方法主要有原子吸收光譜法［1］、原子熒光光譜法［2］、陽(yáng)極溶出伏安法［3］等，但傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法存在著待檢測(cè)樣品前處理復(fù)雜、儀器費(fèi)用高等缺陷，在實(shí)際應(yīng)用中不能廣泛普及.因此，尋求一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的重金屬離子快速檢測(cè)技術(shù)具有重大的意義［4］.基于酶抑制作用并利用分光光度法檢測(cè)食品及環(huán)境中重金屬殘留已逐漸興起，此方法簡(jiǎn)單方便、快速靈敏，并且檢測(cè)樣品及使用藥品的用量少，對(duì)各種重金屬元素的檢測(cè)具有相對(duì)較好的普遍性.

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)具有較好的催化特性，已經(jīng)在許多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如食品、醫(yī)藥、化學(xué)等［5］.重金屬離子作用于葡萄糖氧化酶的活性中心，對(duì)其活性中心具有極強(qiáng)的親和力，較多含量的重金屬離子會(huì)使葡萄糖氧化酶迅速失去活性，導(dǎo)致酶活力下降.同時(shí)，重金屬對(duì)酶具有抑制效應(yīng)，當(dāng)重金屬在生物體內(nèi)沉積后，對(duì)生物體具有毒性，利用酶抑制法還能對(duì)受污染環(huán)境中的重金屬離子的生物毒性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［6］.相關(guān)文獻(xiàn)中提到在反應(yīng)底物中添加指示劑如2，4-二氯苯酚［7］、靛藍(lán)胭脂紅等，當(dāng)?shù)孜锱c重金屬發(fā)生反應(yīng)時(shí)，會(huì)使底物中指示劑的顏色、吸光度等發(fā)生變化，通過(guò)檢測(cè)其被轉(zhuǎn)換的信號(hào)或用肉眼即可區(qū)分酶活性的變化.本研究基于重金屬離子對(duì)酶的抑制作用，在其他研究的基礎(chǔ)上，考察葡萄糖氧化酶對(duì)重金屬Pb2+、Cu2+、Ag+離子的檢測(cè)性能，優(yōu)化反應(yīng)體系，嘗試擬合出一種快速檢測(cè)這3種重金屬離子的數(shù)學(xué)檢測(cè)模型［8］.為今后的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器:TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器);DZKW-122電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);PHS-3C型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器設(shè)備有限公司);電子天平、微量移液器等.

試劑:0.2 mol/L葡萄糖(沈陽(yáng)東興試劑廠);靛藍(lán)胭脂紅(天津科密歐)［9］;0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=5.2);乙酸緩沖液(pH=2.55)［10］;葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4，來(lái)源于 Bomei公司);3 種重金屬標(biāo)準(zhǔn)液:Pb2+標(biāo)準(zhǔn)液:10 μmol/L，根據(jù)乙酸鉛的分子量用乙酸緩沖液配制(pH=2.55);Cu2+標(biāo)準(zhǔn)液:10 μmol/L，根據(jù)硫酸銅的分子量用乙酸緩沖液配制(pH=2.55);Ag+標(biāo)準(zhǔn)液:10 μmol/L，根據(jù)硝酸銀的分子量用乙酸緩沖液配制(pH=2.55);去離子水;其他試劑均為分析純或生物純等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

酶液和葡萄糖溶液置于37℃水浴，將等量的酶液和重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)液混勻，調(diào)整pH后分別置于不同溫度條件下(4℃、室溫21℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃)15 min.另取2 mL溫?zé)岬钠咸烟侨芤?0.2 mol·L－1)和2 mL在不同溫度條件下的反應(yīng)液37℃反應(yīng)10 min后，迅速冰浴，同時(shí)另取離心管分別加入3 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、1.3 mL的靛藍(lán)胭脂紅溶液(1.0×10－3mol/L)、1 mL的冰浴反應(yīng)液，稀釋至25 mL，沸水浴13 min后，流水沖洗冷卻5 min.打開雙光束紫外可見分光光度計(jì)，設(shè)定參數(shù)，在615 nm處，去離子水作參比，分別記錄測(cè)定的吸光度值.對(duì)照組以2 mL乙酸緩沖液(pH=2.55)代替，以上步驟重復(fù)3次.

按溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間的順序，在確定最適溫度后分別進(jìn)行不同 pH(1～7)、反應(yīng)時(shí)間(5、10、15、20、25、30 min)條件的優(yōu)化，最后以最適反應(yīng)條件，考察葡萄糖氧化酶檢測(cè)3種重金屬離子的性能［11］.以吸光度變化值為縱坐標(biāo)，以重金屬離子濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.確定抑制方程、檢出限等技術(shù)指標(biāo)，并利用方差分析確定各指標(biāo)的顯著性.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

由于葡萄糖氧化酶是一種含有兩個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸分子的蛋白，能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸并產(chǎn)生H2O2.H2O2具有氧化性，在一定條件下，能夠使添加的指示劑靛藍(lán)胭脂紅發(fā)生褪色反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)，可利用分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度來(lái)確定產(chǎn)生H2O2的量［12］.而重金屬離子又會(huì)結(jié)合在葡萄糖氧化酶的活性中心，對(duì)其活性中心具有極強(qiáng)的親和力，使葡萄糖氧化酶迅速失去活性，從而導(dǎo)致酶活力下降.從吸光度的變化即可判斷酶活性受抑制的程度［13］.測(cè)得吸光度的變化值ΔA(實(shí)驗(yàn)組吸光度值A(chǔ)1與對(duì)照組吸光度值A(chǔ)0的差值).以變化值ΔA為縱坐標(biāo)，反應(yīng)溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間分別為橫坐標(biāo)，繪制曲線.

2.2 最適反應(yīng)溫度的選擇

采用在pH為3、反應(yīng)時(shí)間為10 min的條件下，設(shè)定不同溫度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示.由圖1可見，通過(guò)與對(duì)照(CK線)進(jìn)行比較，Pb2+在4℃ ～40℃，隨著溫度的升高，吸光度差值變化不明顯，只有很小的波動(dòng);40℃～45℃，隨溫度的升高，吸光度差值突然明顯增加，抑制程度升高，切線的斜率最大;45℃時(shí)，差值最大，說(shuō)明此時(shí)反應(yīng)重金屬離子抑制葡萄糖氧化酶的程度最大，使靛藍(lán)胭脂紅褪色的程度最低;之后隨著溫度的繼續(xù)升高，吸光度差值又迅速降低.因此，在所選擇的的溫度梯度范圍內(nèi)，選擇45℃為Pb2+對(duì)葡萄糖氧化酶抑制反應(yīng)的最適保溫溫度.同理，Cu2+、Ag+的最適溫度分別選擇室溫21℃和40℃.

通過(guò)對(duì)溫度條件的對(duì)比，可以看到Cu2+與葡萄糖氧化酶作用，隨著保溫溫度的升高，吸光度差值變化的更為顯著，其他兩種重金屬離子Ag+和Pb2+與葡萄糖氧化酶作用時(shí)，隨著溫度的升高，吸光度差值在0～0.015的小范圍內(nèi)波動(dòng)，抑制程度相比之下，沒(méi)有Cu2+的現(xiàn)象明顯.

圖1 抑制GOD活性法檢測(cè)重金屬離子的最適溫度Fig.1 Optimal temperature to detect heavy metal ions by GOD activity inhibiting method

2.3 最適反應(yīng)pH的選擇

反應(yīng)溶液的pH環(huán)境不但會(huì)影響酶分子的穩(wěn)定性，還會(huì)影響酶與底物的作用，組成酶活性中心的氨基酸殘基側(cè)鏈存在不同的基團(tuán)，pH環(huán)境的變化會(huì)影響到這些基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響酶促反應(yīng)的速度.按照實(shí)驗(yàn)方法在pH 1.0～7.0范圍內(nèi)，在最適溫度下，考察pH對(duì)Pb2+、Cu2+、Ag+抑制葡萄糖氧化酶作用的影響.由圖2可知，最適宜反應(yīng)的pH分別為:pH為5(Pb2+)、pH為3(Cu2+)、pH為6(Ag+).由實(shí)驗(yàn)組所得吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，Pb2+、Cu2+的實(shí)驗(yàn)組吸光度得到的P值小于0.01，所以pH對(duì)Pb2+、Cu2+抑制葡萄糖氧化酶的程度有極為顯著的影響;Ag+的P值小于0.05，所以pH對(duì)Ag+的影響較為顯著.

通過(guò)pH的變化對(duì)比可見:Pb2+抑制葡萄糖氧化酶的吸光度差值變化在0.002～0.015范圍內(nèi)，Cu2+在0.007～0.036范圍內(nèi)波動(dòng)，Ag+在0.014～0.038范圍內(nèi)波動(dòng)，Cu2+的吸光度波動(dòng)范圍最大，同樣證明 Cu2+對(duì)pH的變化在3種重金屬中最為敏感.雖然酶在一定pH值范圍內(nèi)有較高的活性，pH太高或太低都會(huì)影響酶的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cu2+在pH為3這樣相對(duì)較低的環(huán)境下對(duì)葡萄糖氧化酶產(chǎn)生了明顯的抑制作用，但經(jīng)對(duì)照比較可以證明發(fā)生的褪色反應(yīng)確實(shí)是由于重金屬離子產(chǎn)生了較大的抑制作用造成的.同時(shí)，在湯琳等的研究中提到，酶電極的pH值適應(yīng)范圍最低可達(dá)2.55.結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在較低的pH條件下，電子的傳遞速率增大，可能對(duì)重金屬離子與酶活性中心的結(jié)合有一定的促進(jìn)作用.

2.4 最適反應(yīng)時(shí)間的選擇

將重金屬離子溶液和葡萄糖氧化酶混合液在最適反應(yīng)溫度條件下放置不同反應(yīng)時(shí)間t，調(diào)節(jié)為最適pH，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)重金屬離子抑制葡萄糖氧化酶的影響.由不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶抑制程度的影響(圖3)可知，在一定范圍內(nèi)，不同重金屬離子對(duì)酶的抑制程度都會(huì)隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加，增大到一定程度后又會(huì)受到抑制，所以，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，選擇Pb2+、Cu2+、Ag+對(duì)葡萄糖氧化酶抑制反應(yīng)的最適反應(yīng)時(shí)間分別為15、25、20 min，此時(shí)，每種重金屬離子對(duì)葡萄糖氧化酶的抑制作用最大.

通過(guò)比較分析，在5～15 min范圍內(nèi)，3種重金屬離子抑制葡萄糖氧化酶的吸光度差值變化都不大，均在0.015上下波動(dòng)，直至達(dá)到Ag+的最適反應(yīng)時(shí)間20 min時(shí)3種重金屬的抑制程度呈現(xiàn)相對(duì)較大的差異;20 min時(shí)，抑制程度Pb2+＜Cu2+＜Ag+;隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，達(dá)到Cu2+的最適反應(yīng)時(shí)間25 min.通過(guò)方差分析，結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間對(duì)鉛離子抑制葡萄糖氧化酶程度的影響不顯著，而Cu2+離子、Ag+離子的P值小于0.05，說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間對(duì)Cu2+離子、Ag+離子抑制葡萄糖氧化酶的程度相對(duì)顯著.盡管方差分析表明，反應(yīng)時(shí)間對(duì)Pb2+抑制葡萄糖氧化酶活性的差異不顯著，但是在第15 min時(shí)，Pb2+處理組的反應(yīng)體系的吸光度最高，達(dá)到0.018.因此，檢測(cè)Pb2+的最適反應(yīng)時(shí)間t定為15 min.

圖2 抑制GOD活性法檢測(cè)重金屬離子的最適pHFig.2 Optimal pH to detect heavy metal ions by GOD activity inhibiting method

圖3 抑制GOD活性法檢測(cè)重金屬離子的最適反應(yīng)時(shí)間Fig.3 Optimal reaction time to detect heavy metal ions by GOD activity inhibiting method

圖4 GOD受重金屬離子Pb2+、Cu2+、Ag+抑制的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curves of GOD activity inhibited by the heavy metal ions

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最適反應(yīng)體系下，選擇不同的濃度重金屬離子溶液繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè).以抑制率為縱坐標(biāo)，重金屬離子濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，將所得數(shù)據(jù)利用Origin 8軟件進(jìn)行擬合曲線，確定抑制方程，所得結(jié)果如表1 所示，Pb2+、Cu2+、Ag+分別在10 ～100 μmol/L、4 ～80 μmol/L、10 ～100 μmol/L 范圍內(nèi)存在線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，說(shuō)明利用該方法對(duì)重金屬離子進(jìn)行檢測(cè)具有一定的可靠性.通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得3種重金屬離子的空白樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)分別為 2.47%、1.71%、1.96%.相比之下，RSD 值較小，誤差較低［14］.且可求出 Pb2+、Cu2+、Ag+的檢出限分別為 0.53、0.21 和 0.18 μmol/L.對(duì)圖4中3種重金屬標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較可見，Pb2+、Cu2+和Ag+對(duì)酶活性具有明顯的抑制作用，獲得的曲線在一定范圍具有良好的線性關(guān)系，Cu2+的斜率最大，表明受抑制效果相對(duì)明顯，Pb2+、Ag+雖然沒(méi)有Cu2+的抑制效果明顯，但是這兩種重金屬具有相對(duì)較寬的檢測(cè)范圍.

表1 抑制酶活性法檢測(cè)重金屬離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性響應(yīng)范圍Tab.1 Standard curve equation and linear response range to detect heavy metal ions by enzymatic activity inhibiting method

2.6 分析與討論

實(shí)驗(yàn)建立葡萄糖氧化酶檢測(cè)Pb2+、Cu2+和Ag+的反應(yīng)體系，并對(duì)檢測(cè)每種重金屬離子的最適反應(yīng)溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化.選擇靛藍(lán)胭脂紅為指示劑，根據(jù)周建芹等的相關(guān)研究確定靛藍(lán)胭脂紅用量為1.3 mL［15］.研究中葡萄糖氧化酶用量及顯色劑用量使用合理，反應(yīng)時(shí)間適宜，研究結(jié)果就較為合理.基于重金屬離子對(duì)葡萄糖氧化酶活性的抑制作用，得到的最佳工藝條件如表2所示.在最佳工藝條件下，選擇不同濃度重金屬離子溶液進(jìn)行試驗(yàn)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，在一定范圍內(nèi)，3種重金屬離子對(duì)葡萄糖氧化酶活性的抑制具有良好的線性關(guān)系，即酶抑制法對(duì)重金屬離子的快速檢測(cè)具有較高的靈敏性;利用該方法得到的檢出限比翟彤寧［16］、劉京萍［17］等人利用其他方法得到的銅離子和鉛離子的最低檢出濃度更低.連蘭［18］等人利用生物傳感器的方法測(cè)得銅離子抑制酶電極活性得到的線性范圍是0～1.5 μmol/L，李彤［19］等人應(yīng)用二氧化硅溶膠-凝膠固定化酶技術(shù)制備葡萄糖氧化酶電極檢測(cè)重金屬離子的方法測(cè)得的線性范圍0～1.5 μmol/L和0～60 μmol/L，以及利用其他傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)能夠檢測(cè)的線性范圍較窄［20］，相比之下，本實(shí)驗(yàn)方法具有的差異性較為顯著.

表2 抑制GOD活性檢測(cè)重金屬離子的最佳反應(yīng)體系Tab.2 Optimal reaction system to detect heavy metal ions by GOD activity inhibiting method

3 結(jié)論

利用靛藍(lán)胭脂紅褪色的原理并結(jié)合分光光度法對(duì)重金屬離子抑制葡萄糖氧化酶活性的檢測(cè)方法能夠獲得的線性范圍更寬，具有顯著的差異［21-22］.通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立數(shù)學(xué)模型確定的抑制方程置信度均在99%以上，說(shuō)明該方法具有充分的理論依據(jù)及可行性.

本研究中只進(jìn)行了單一重金屬離子的檢測(cè)，在實(shí)際應(yīng)用中，需要檢測(cè)的未知液大多為重金屬的混合液，若存在離子之間的相互干擾問(wèn)題，只需加入合適的掩蔽劑就可以排除各種干擾，因而該研究為環(huán)境中多元素的同時(shí)分析提供了參考.另外，此方法還可以設(shè)計(jì)成相關(guān)的試劑盒，用于重金屬離子更為快速、便捷的檢測(cè).

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