譚清坡 田占坤 趙永芳 王迎霞 王欣 郭文杰 高三花

·論著·

急性一氧化碳中毒對大鼠腦血管α-肌動蛋白和β-淀粉樣蛋白的影響

譚清坡 田占坤 趙永芳 王迎霞 王欣 郭文杰 高三花

目的通過對一氧化碳中毒大鼠腦內(nèi)小血管壁結(jié)構(gòu)變化的研究，探討一氧化碳中毒后腦組織的血管壁結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，可能為闡明遲發(fā)性腦病的發(fā)病機制提供線索。方法免疫組化和圖像分析法，動態(tài)觀察一氧化碳中毒大鼠腦內(nèi)小血管壁α-肌動蛋白和β-淀粉樣蛋白。結(jié)果與對照組相比，急性一氧化碳中毒大鼠的小血管壁中α-肌動蛋白、β-淀粉樣蛋白均有顯著改變(P<0.05)。結(jié)論α-肌動蛋白、β-淀粉樣蛋白在一氧化碳中毒大鼠腦組織的血管壁結(jié)構(gòu)變化中起著重要的作用。

一氧化碳中毒；α-肌動蛋白；β-淀粉樣蛋白；大鼠

一氧化碳是生產(chǎn)生活中最常見的化學(xué)性窒息性氣體之一[1]。部分一氧化碳中毒患者回復(fù)正常或接近正常后，可能表現(xiàn)以癡呆為主的急性精神癥狀，臨床稱為“遲發(fā)性腦病”，致死率和致殘率都很高，預(yù)后較差。遲發(fā)型腦病發(fā)病機制尚不十分清楚，腦血管損害是其主要原因。α-肌動蛋白和β-淀粉樣蛋白在血管構(gòu)建中其重要作用，本研究通過動態(tài)觀察CO中毒大鼠腦內(nèi)α-肌動蛋白、β-淀粉樣蛋白的變化情況，進而研究CO中毒大鼠腦組織血管壁結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，以期為遲發(fā)性腦病的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 儀器與藥品 光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS BX51T-PHD-J11；電子透射顯微鏡，德國JEM-2000Ex；多功能彩色圖像分析系統(tǒng)，美國Image-Pro Plus6.0。α-肌動蛋白抗體、β淀粉樣蛋白抗體、免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物公司。99.9%CO氣體(市售)。

1.2 動物及分組 清潔級健康SD大鼠108只，雄性，體重180～220 g，河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀) 2008-1-003。實驗前1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由進食飲水。動物隨機等分為空氣對照組和染毒組，每組按時間點各設(shè)9個亞組：6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d，每個亞組6只大鼠。

1.3 標(biāo)本制備及免疫組化檢測 單次腹腔注射式染毒法建立CO中毒大鼠模型，對照組腹腔注射等量空氣[2]。動物經(jīng)10%水合氯醛(300 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，打開胸腔，行左心室灌流，4%多聚甲醛固定。依各個時間點灌注、固定后取蒼白球區(qū)腦組織置恒冷切片機中連續(xù)切片，切片厚20 μm。腦片經(jīng)水化、抗原修復(fù)，分別加入α-肌動蛋白(1∶100)、β淀粉樣蛋白(1∶200)。按試劑盒操作說明，依次加入生物素標(biāo)記的二抗、三抗，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明、封片。檢測不同時間點α-肌動蛋白、β-淀粉樣蛋白的表達情況。

1.4 圖像分析 采用美國Imagepro-Plus 6.0軟件圖像分析系統(tǒng)，高倍鏡下( 10 × 20) 每張切片分別選取外徑相近、圓整小動脈各5個，測定測試區(qū)域陽性產(chǎn)物的灰度值(GA)和面積(n)及背景的灰度值(GB)和背景面積(m)。利用免疫組化定量計算公式：PU=|GA-GB|/Aα×Gmax×100，計算陽性單位(PU)值。Aα為陽性產(chǎn)物在所選區(qū)域中的面積密度，Aα=n/(m+n)；Gmax為圖像分析系統(tǒng)的最大灰度分級，為256。

2 結(jié)果

2.1 大鼠CO中毒后α-肌動蛋白變化 對照組血管壁上可見α-肌動蛋白陽性表達，不同時間點表達情況未見明顯變化。染毒組亦可見α-肌動蛋白表達，PU值先低后高呈V型變化，2 d時PU值表達最低，顯著低于同期對照組(P<0.05)，21 d時PU值表達最高，顯著高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 CO染毒大鼠腦組織血管α-肌動蛋白PU值表達變化比較

組別PU值6h1d2d3d4d7d14d21d28d對照組24.1±3.424.4±3.024.8±2.824.4±4.024.4±4.023.9±3.224.3±3.324.6±3.124.5±3.6染毒組22.7±3.221.9±2.020.8±3.2*22.8±3.423.1±3.225.8±3.026.9±3.532.6±3.2#32.0±3.6#

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01，

2.2 大鼠CO中毒后β-淀粉樣蛋白變化 對照組各個時間點血管壁均無陽性表達。染毒組3 d后β-淀粉樣蛋白表達顯著增高，中期達峰值。與對照組相比，中毒組3～21 d β-淀粉樣蛋白表達顯著增高(P<0.05)，至28 d時β-淀粉樣蛋白表達呈陰性。見圖1～3。

圖1 染毒組β-淀粉樣蛋白PU值表達變化

圖2 對照組14 d β-淀粉樣蛋白(HE×400) 圖3 染毒組14 d β-淀粉樣蛋白(HE×400)

3 討論

血管由外膜、中膜和內(nèi)膜構(gòu)成，中膜平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞，在血管活性和血管壁重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。平滑肌細(xì)胞表達增多及表型的改變，導(dǎo)致多種心腦血管疾病的發(fā)生。α-肌動蛋白被認(rèn)為是平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物，正常生理條件下，平滑肌細(xì)胞體積較小，α-肌動蛋白含量較多；病理改變時，細(xì)胞向合成型轉(zhuǎn)變，細(xì)胞體積增大，分泌增殖能力增強，α-肌動蛋白含量減少。本研究以α-肌動蛋白為指標(biāo)，觀察了CO中毒大鼠小動脈平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白表達情況，研究發(fā)現(xiàn)，作為平滑肌增殖分化標(biāo)志之一的α-肌動蛋白染毒后2 d達到最低點，并逐漸增大至

第21天達到高峰。結(jié)果表明在CO中毒初期，由于缺血缺氧等刺激因素，平滑肌細(xì)胞增殖分泌增加，表現(xiàn)出向合成型轉(zhuǎn)變，后期隨著損傷因素的緩解，增殖增生可得到緩解，細(xì)胞恢復(fù)為收縮型。

β-淀粉樣蛋白表達異常表達會導(dǎo)致阿爾茨海默病的的發(fā)生發(fā)展[3，4]。新的研究表明，在腦缺血的損傷過程也表現(xiàn)出β-淀粉樣蛋白表達異常。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血缺氧可以通過多種途徑影響腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白的生成和清除機制，導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白在腦內(nèi)異常增多；慢性缺氧可導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白的生成增加[5，6]。β-淀粉樣蛋白表達增多，可導(dǎo)致淀粉樣血管病和阿爾茨海默病。CO中毒早期β-淀粉樣蛋白的出現(xiàn)，可能是與缺氧導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白的生成及清除機制失衡有關(guān)。隨著大腦清除β-淀粉樣蛋白機制的恢復(fù)，β-淀粉樣蛋白逐漸減少直至消失。本研究首次發(fā)現(xiàn)β-淀粉樣蛋白在CO中毒大鼠腦組織的異常表達，且表達峰值出現(xiàn)在染毒后7～14 d，與遲發(fā)型腦病的“假愈期”相吻合，提示β-淀粉樣蛋白的異常沉積可能是導(dǎo)致與遲發(fā)型腦病發(fā)生發(fā)展的原因之一。

1 Raub JA,Mathieu Nolf M,Ham P NB,et al.Carbon monoxide a public health perspective.Toxicology,2000,145:1-14.

2 王蘇平,田占坤,王曉虹,等.急性一氧化碳中毒大鼠腦內(nèi)小血管壁結(jié)構(gòu)的變化.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2012,29:343-345.

3 Vardy ER,Catto AJ,Hooper NM.Proteolytic emeehanisms inamyloid- beta metabolism: therapeutic implications for Alzheimer’s disease.Trends Mol Med，2005， 11: 464- 472.

4 Yamaguchi H,Yamazaki T,Lemere CA,et al.β- amyloid is focally deposited within the outer basement membrane in the amyloid angiopathy of Alzheimer＇s disease.An immunoelectron microsco pic study.AM J Pathol，1992,141:249-259.

5 Effect of hypoxia/ischemia and hypoxic preconditioning/reperfusion on expression of some amyloid-degrading enzymes.Ann N Y Acad Sci，2004，1035:21-33.

6 鄭瑩，閆福嶺.腦缺血對腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白清除的影響.中國腦血管病雜志，2007,4:186-190.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.015

061036 河北省滄州市，中國人民解放軍空軍95809部隊醫(yī)院(譚清坡)；河北省任丘市人民醫(yī)院內(nèi)三科(田占坤、趙永芳、王迎霞、王欣、郭文杰)，中西醫(yī)結(jié)合科(高三花)

田占坤，060000 河北省任丘市人民醫(yī)院； E-mail:tianxia.643@163.com

R 135.1+4

A

1002-7386(2014)11-1643-02

2013-12-11)