劉靜波 侯燕燕 齊曦明 唐利娟 周文文 彭勇 楊雁鴻

·論著·

維生素D受體基因多態(tài)性與肺腺癌易感性的關系

劉靜波 侯燕燕 齊曦明 唐利娟 周文文 彭勇 楊雁鴻

目的探討維生素D受體(VDR)等位基因多態(tài)性與肺腺癌易感性的關系。方法172例河北漢族肺腺癌患者和180例健康對照。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性的方法對VDR的Bsm1、Fok1等位基因多態(tài)性與肺腺癌的關系進行研究。結果肺腺癌組VDR基因Bsm1位點基因型分布、等位基因分布Fok1位點基因型分布與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為8.111和6.492,P<0.05)。Fok1位點基因型分布，其等位基因分布與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論VDR基因Bsm1位點多態(tài)性與肺腺癌發(fā)病風險相關聯(lián)。Bsm1位點B等位基因可能增加肺腺癌的發(fā)病風險。VDR基因Fok1位點多態(tài)性與肺腺癌發(fā)病風險可能關聯(lián)。

多態(tài)性;維生素D;肺腫瘤;易感性

肺癌作為臨床最為常見的惡性腫瘤，其病死約占所有癌癥死亡的17.8%，據相關資料統(tǒng)計，我國目前每年新發(fā)數約有50萬，呈逐年遞增趨勢[1]。其中75%～85%的肺癌發(fā)病中為非小細胞肺癌，2/3確診時已屬晚期[2]。而肺腺癌是非小細胞肺癌中最常見、預后最差的類型之一，據研究資料表明，肺腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢，在很多國家超過了鱗癌成為最常見的肺癌組織學類型。VDR是核受體超家族的成員，已有大量研究表明，VDR基因多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有明顯的相關性[3]。本實驗擬研究VDR基因多態(tài)性與肺腺癌易感性之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年10月至2013年3月，秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤科住院的晚期腺癌患者(均為ⅢB期/Ⅳ期)172例，所有病例均有病理學診斷依據，除外其他癌癥患者及合并糖尿病、心血管疾病等。對照組為同期隨機在秦皇島市第一醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康體檢者180例。病例組及健康對照組均來自秦皇島市及周邊的中國漢族人。肺腺癌組中，男82例，女90例；平均年齡(64±11)歲。對照組中，男85例，女95例；平均年齡(63±11)歲。2組一般資料有均衡性。

1.2 方法 采用外周血DNA提取試劑盒提取DNA，Marker ⅠDNA 及l(fā)adder DL2000 Marker是Solarbio及天根生化科技有限公司產品，TaqDNA聚合酶和其緩沖液及4dNTPs購自Promega，Bsm1及Fok1限制性內切酶購自Biolabs。引物的序列由基因庫公布的VDR基因序列合成，并采用DNAman的程序設計，合成公司為北京鼎國昌盛生物公司。最后根據酶切結果挑選各個位點不同基因型的PCR產物進行測序，由北京鼎國昌盛生物技術有限公司完成，以驗證擴增產物為目的片段并且確定基因型。先采集外周靜脈全血2 ml，然后用外周血DNA分離試劑盒來提取DNA。Bsml位點PCR反應體系的總量為25 μl，Fok1位點PCR反應體系的總量為25 μl，其中有基因組DNA、TaqDNA聚合酶和引物TaqDNA聚合酶緩沖液。Bsml上游的引物(5’-3’)為GGCAACCTGAAGGGAGACGTA，下游的引物(5’-3’)為CTCTTTGGACCTCATCACCGAC。通過編好程序的PCR儀進行PCR擴增，其反應參數如下：Bsml位點PCR反應條件為95℃預變性5 min，94℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸40 s，共計30個循環(huán)。最后一個循環(huán)為72℃延伸5 min。Fok1上游的引物(5’-3’)為CTCCGAAGGCACTGTGCTCAGGCCT,下游的引物(5’-3’)為ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC。其反應參數如下：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共計30個循環(huán)。最后一個循環(huán)為72℃延伸10 min。Bsml位點及Fok1位點的PCR產物分別加入相應的限制性內切酶5 μl和緩沖液，Bsm1位點限制性內切酶的產物在65℃恒溫箱16 h，然后對酶切產物電泳。Fok1位點限制性內切酶的產物在37℃恒溫箱16 h，然后對酶切產物電泳。

1.3 結果判斷 VDR基因的第8內含子rs1544410位點多態(tài)性對應Bsml限制性酶切位點位點為堿基A→G突變。65℃恒溫箱16 h，A等位基因純合子表現為461 bp一個條帶，命名為BB基因型；G等位基因純合子表現為258 bp和 203 bp兩個條帶，命名為bb基因型；雜合子狀顯示為 461 bp， 258 bp，和203 bp3個條帶，命名為Bb基因型。VDR基因的第2外顯子rs10735810位點多態(tài)性對應Fok1限制性酶切位點，為堿基T→C的突變。T等位基因純合子表現為265 bp一個條帶，命名為FF基因型；C等位基因純合子顯示為207 bp和60 bp2個條帶，命名為ff基因型；雜合子顯示為 265 bp，207 bp和60 bp3個條帶，命名為Ff基因型。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SAS 9.2統(tǒng)計軟件，病例組與對照組組間VDR基因型分布概率的比較采用χ2檢驗，關于肺腺癌的危險的因素，選擇應用非條件Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Bsm1及Fok1酶切后的電泳結果 Bsm1位點各基因型的條帶數目和位置見圖1，Fok1位點各基因型的條帶數目和位置，見圖2。

2.2 VDR Bsm1位點及 Fok1位點基因型分布 病例組VDR基因Bsm1位點基因型分布、等位基因分布Fok1位點基因型分布與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為8.111和6.492,P<0.05)。Fok1位點基因型分布，其等位基因分布與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

3 討論

VDR是介導1,25(OH)2D3發(fā)揮生物學效應，為甲狀腺激素、類固醇激素受體超家族成員。維生素D在正常組織內有促進細胞分化、抑制細胞生長的作用[4]，這種功能受轉錄調節(jié)因子VDR 的調節(jié)。1,25(OH)2D3即活性維生素D在體內具有多方面的活性，可維持鈣、磷平衡和骨代謝。此外，1,25(OH)2D3在腫瘤的預防和治療方面也起著重要作用[5-7]。許多體內、體外實驗都證實了1,25(OH)2D3對肺癌的抑制作用[8]。VDR基因多態(tài)性的相關性研究主要集中在骨質疏松、甲狀旁腺功能亢進、腫瘤、佝僂病及尿石癥等疾病方面。核受體狀況可能成為NSCLC的預后指標。評估VDR基因多態(tài)性對VDR表達的影響，需要針對維生素D信號通路可能是通過在目標肺癌組織中VDR的身份影響治療[9]。目前檢測的VDR基因多態(tài)性酶切的位點分別為Cdx-2、Apa1、Bsm1、Fok1和Taq1。

圖1 VDR-PCR產物經Bsm1酶切后的電泳圖

圖2 VDR-PCR產物經Fok1酶切后的電泳圖

表1 2組人群VDR的Bsm1及Fok 1基因多態(tài)性分布 例

本研究應用Bsm1和Fok1限制性內切酶對河北秦皇島籍漢族172例晚期肺腺癌及180例健康成人的VDR基因多態(tài)性進行對比分析，結果發(fā)現兩組VDR基因Bsm1位點多態(tài)性與晚期肺腺癌發(fā)病風險相關聯(lián)。Bsm1位點B等位基因可能增加肺腺癌的發(fā)病風險。VDR基因Fok1位點多態(tài)性與晚期肺腺癌發(fā)病風險可能關聯(lián)。這一結果與Dogan等[10]的研究結果不一致，Dogan發(fā)現降低VDR活性的Taq1多態(tài)性基因可能是患肺癌的危險因素，而性別、年齡、吸煙可能加重這一因素的影響。Zhou等[11]發(fā)現VDR基因多態(tài)性與早期肺腺癌患者生存率之間無明顯關聯(lián)，VDR基因多態(tài)性可能與早期NSCLC的鱗狀細胞癌患者的生存率提高有關。VDR與肺癌相關性的研究目前國內尚未見報道。近年國內外有大量關于VDR基因的研究報道，顯示VDR基因位點的基因型及等位基因的分布因人種不同而差異較大[1-5]。如Bsm1位點，我國人群中等位基因B頻率約為10%，略低于日本人(15%～20%)，與韓國人相近(約11%)。而在高加索人群中，等位基因B頻率可達35%以上。就基因型比例，我國人群中bb型較多，達90%以上，Bb型次之，而BB型低于2%。而在高加索人群中，則以Bb型居多，約45%～55%，BB型為18%以上。本研究結果與部分文獻報道出現的結果不同，其原因可能為秦皇島坐落于中國河北省的東北部，其季風氣候為暖溫帶半濕潤大陸性，也可能與研究對象的種族差別、環(huán)境暴露因素、接觸致癌因素的迥同及未省的混同因素有關[12-15]。需要在其他不同人群中反復實驗以及進一步擴增樣本量繼續(xù)進行研究，來進一步驗證實驗結果。

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RelationshipbetweengenepolymorphismsofvitaminDreceptorandsusceptibilityoflungadenocarcinoma

LIUJingbo*,HOUYanyan,QIXiming*,etal.*TheFirstHospitalofQinhuangdaoCity,Hebei,Qinhuangdao066000,China

ObjectiveTo explore the correlation between gene polymorphisms of vitamin D receptor (VDR) and susceptibility of lung adenocarcinoma.MethodsThe 172 patients with lung adenocarcinoma (lung adenocarcinoma group) and 180 healthy subjects (control group) were enrolled in the study,and all the subjects were Chinese Han people in Hebei province. The correlation between allele polymorphism of Bsm1,Fok1 site of VDR and lung adenocarcinoma was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method.ResultsThere were significant differences in genotype distribution and Bsm1 genotype distribution of VDR gene between lung adenocarcinoma group and control group (χ2=8.111 and 6.492,P<0.05). However there were no significant differences in genotype distribution and Bsm1 genotype distribution of VDR gene between lung adenocarcinoma group and control group (P>0.05).ConclusionBsm1 gene site polymorphism of VDR gene is closely correlated to pathogenesis risk of advanced lung adenocarcinoma. Bsm1 B allele may increase the pathogenesis risk of lung cancer.Fok1 site polymorphism of VDR may be related with pathogenesis risk of lung cancer.

polymorphisms; vitamin D;lung neoplasms; susceptibility

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.12.007

066000 河北省秦皇島市第一醫(yī)院(劉靜波、齊曦明、唐利娟、楊雁鴻)；承德醫(yī)學院(侯燕燕、周文文)；燕山大學(彭勇)

楊雁鴻，066000 河北省秦皇島市第一醫(yī)院；

E-mail：yyh_0615@163.com

R 734.2

A

1002-7386(2014)12-1780-03

2013-12-16)