★ 溫瑩瑩 傅春華* 弓麗華 黃金珠 周昕

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 四川 成都 610075)

不孕癥是婦科臨床的常見病，正成為全球生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個緊迫和日益引起關(guān)注的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問題。據(jù)統(tǒng)計不孕癥在我國的發(fā)病率約為10%[1]，而排卵功能障礙型不孕約占女性不孕癥的25%～30%[2]。以“補(bǔ)腎調(diào)沖”立法的通脈大生片是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，應(yīng)用于臨床50多年，其促排卵作用已被大量臨床病例所證實(shí)，具有確切療效[3]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過建立腎虛排卵障礙型不孕大鼠模型，用熒光定量RT-PCR方法檢測大鼠卵巢FSHR mRNA表達(dá)量，闡明通脈大生片對卵泡發(fā)育和促排卵的干預(yù)環(huán)節(jié)，從分子生物學(xué)角度探討其作用機(jī)制，進(jìn)一步深化補(bǔ)腎調(diào)沖法促排卵的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級9日齡相同日期出生的雌性SD大鼠200只。四川簡陽達(dá)碩生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXF(川)2008-24。

1.2 藥物 通脈大生片(規(guī)格：每片含0.3g原生藥)，批號：川藥制字20130530，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生產(chǎn)。來曲唑(規(guī)格：2.5mg)，批號：國藥準(zhǔn)字H19991001，由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。右歸丸(規(guī)格：1.8g/10粒)，批號：國藥準(zhǔn)字Z41022170，由河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)。丙酸睪酮注射液(規(guī)格：1mL：25mg)，批號：國藥準(zhǔn)字H12020531，由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑 Eastep通用型總RNA 提取試劑盒(LS1000)，Promega；RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(K1621)，F(xiàn)ermentas；Maxima SYBR Green/ROX qPCR預(yù)混液(K0221)，Thermo Scientific；DEPC(Sigma)。

1.4 主要器材 高分辨率熔點(diǎn)曲線分析儀(BIO-RAD，CFX96)；電泳儀及電泳槽 (北京六一)；凝膠圖像分析系統(tǒng)(BIO-RAD)；超低溫冰箱(SANYO，MDF-U50V)；高速冷凍離心機(jī)(Sigma，1-15K)等。

2 方法

2.1 造模 參照余瑾等[4]方法復(fù)制排卵障礙型不孕大鼠模型。取9日齡SD雌鼠180只(實(shí)驗(yàn)組)，于頸背部皮下注射丙酸睪丸酮1.25mg/只(0.05mL/只)。第22日齡斷奶，同等條件飼養(yǎng)，由專人喂養(yǎng)。若大鼠表現(xiàn)為體重肥胖，易驚易怒，豎毛，毛質(zhì)晦暗發(fā)黃，脫毛(以上表現(xiàn)與空白組進(jìn)行對照)，提示腎虛證造模成功。待70日齡，大鼠陰道開口，連續(xù)陰道涂片2個性周期(1個性周期5天)。若陰道上皮無周期變化，呈持續(xù)性角化，提示排卵障礙大鼠模型造模成功。

2.2 分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將126只實(shí)驗(yàn)組大鼠分為疾病模型組(簡稱模型組)、通脈大生片高、中、低劑量組(簡稱通高、中、低組)、右歸丸組、來曲唑組，每組各21只，加上正常組20只，共7組。

2.3 給藥 從80日齡起，分別按如下方法稱重灌胃，每天1次。以臨床成人60kg體重為標(biāo)準(zhǔn)，按照體表面積-劑量換算法計算大鼠給藥劑量。按1mL/(100g·d)體重灌胃，通高、中、低組分別按臨床成人用藥量的20倍、10倍、5倍灌胃；右歸丸組按臨床成人用藥量的10倍灌胃；來曲唑組按臨床成人用藥量的10倍灌胃，連續(xù)灌胃2天后停藥3天，并予陰道涂片。直至陰道涂片提示陰道脫落細(xì)胞出現(xiàn)有規(guī)律的周期性變化后停藥。于灌胃5周時出現(xiàn)陰道脫落細(xì)胞周期性變化。

2.4 標(biāo)本采集 第105日齡時處死各組大鼠，剖腹，取出卵巢組織，剝離干凈后觀察卵巢形態(tài)并稱重，記錄卵巢各項指標(biāo)。于-80℃保存用于mRNA的定量分析。

2.5 卵巢組織FSHR mRNA表達(dá)量的測定

2.5.1 總RNA的提取 卵巢組織勻漿后，按照RNA 提取試劑盒(Promega)說明書抽提大鼠卵巢總mRNA。1%瓊脂糖凝膠電泳(80V/cm，30min)鑒定總RNA質(zhì)量。

2.5.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。(1)反應(yīng)體系(20μL體系)：2μL總RNA，1μL Oligo(dT)18引物，9μL Rnase-free Water，4μL 5×Reaction Buffer，1μL RNA酶抑制劑，2μL 10mM dNTP Mix，1μL M-MulV反轉(zhuǎn)錄酶。(2)反應(yīng)條件：65℃孵育5min，42℃孵育60min。70℃加熱5min終止反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-80℃保存。

2.5.3 熒光定量PCR反應(yīng) 以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，對FSHR mRNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。

2.5.3.1 引物設(shè)計與合成 NCBI檢索大鼠FSHR基因序列，用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程有限責(zé)任公司合成。引物序列如表1。

表 1 引物信息

2.5.3.2 PCR 過程 將總RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 進(jìn)行連續(xù)5倍濃度稀釋，以各稀釋度為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化。(1)優(yōu)化后的反應(yīng)體系(10μL體系)：Maxima SYBR Green/ROX qPCR預(yù)混液5μL，上游引物(0.5μmol/L)0.5μL，下游引物(0.5μmol/L)0.5μL，cDNA(稀釋60倍)3μL， Rnase-free Water 1μL。(2)FSHR和β-actin優(yōu)化后的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃ 10s，60℃ 60s，72℃ 15s，40個循環(huán)。每樣本做4個復(fù)孔。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠卵巢形態(tài)學(xué)的影響(肉眼觀) 模型組卵巢蒼白，表面見較少卵泡，且卵泡較??；各用藥組和正常組卵泡數(shù)目明顯多于模型組，卵泡明顯增大；尤以來曲唑組最為明顯，通高、中組和正常組次之。

3.2 對卵巢指數(shù)的影響 如表2。

表 2 各組大鼠卵巢指數(shù)的比較

由表1可知，與正常組卵巢指數(shù)比較，模型組明顯降低，組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組卵巢指數(shù)比較，通高組升高，組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，通中、低組和右歸丸組也有所升高，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，來曲唑組升高明顯，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；通脈大生片各劑量組比較，以通高組卵巢指數(shù)升高幅度最大，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 FSHR mRNA表達(dá)量 見表3。與正常組比較，模型組卵巢降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各用藥組與模型組比較，通高組上調(diào)且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，通中組、來曲唑組均上調(diào)且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，通低組、右歸丸組亦有所升高，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；通脈大生片各劑量組比較，通高組、通中組上調(diào)的幅度明顯高于通低組，其中尤以通中組上調(diào)幅度最為顯著。

表3 各組大鼠卵巢組織FSHR mRNA相對表達(dá)量的比較

3.4 卵巢重量與卵巢FSHR mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析 如圖1。

圖1 卵巢重量與卵巢FSHR mRNA表達(dá)量的相關(guān)性

由圖1可知，經(jīng)Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明大鼠卵巢指數(shù)與卵巢FSHR mRNA表達(dá)量存在統(tǒng)計學(xué)弱正相關(guān)性(P<0.01，r=0.455)。

4 討論

《素問·上古天真論》曰：“女子二七，天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子。”中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精，主生殖”，腎與天癸、沖任、胞宮密切相關(guān)。腎精充盛，則卵子發(fā)育成熟，腎陽鼓動，則沖任氣血調(diào)暢，從而促進(jìn)成熟卵子的排出。故排卵障礙多責(zé)之于腎虛沖任失調(diào)。中醫(yī)臨床針對排卵障礙多從溫腎益精，調(diào)補(bǔ)沖任論治?！把a(bǔ)腎調(diào)沖法”作為中醫(yī)治療排卵障礙型不孕的治療大法，在臨床療效中表現(xiàn)明顯的優(yōu)勢。

通脈大生片是根據(jù)四川名老中醫(yī)卓雨農(nóng)自制方“通脈大生丸”研制的院內(nèi)制劑，臨床用于治療婦科疾病60多年，尤其在治療無排卵性功血和排卵障礙型不孕方面取得了肯定的療效。方由17味中藥組成，包括杜仲、續(xù)斷、菟絲子、桑寄生、山藥、肉蓯蓉、當(dāng)歸、枸杞子等。諸藥配伍共湊補(bǔ)腎養(yǎng)肝，調(diào)補(bǔ)沖任，和血通脈之效，因此該方是以補(bǔ)腎調(diào)沖為治療大法的典型方劑之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鹿角膠、桑寄生具有抗氧化抗衰老的作用。菟絲子和續(xù)斷中均含有黃酮類成分，具有促排卵的作用，其改善腎虛排卵障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)可能基于其主要成分黃酮的作用[5]，為菟絲子溫補(bǔ)腎陽的中醫(yī)功效提供了科學(xué)依據(jù)。韋敏等報道[6]，枸杞中的多糖成分對自然衰老雌鼠卵巢有保護(hù)作用，其機(jī)制與影響性激素和IGF-β的分泌有關(guān)。當(dāng)歸有降低大鼠纖維蛋白原的作用[7]，可能通過影響卵巢局部血液流變學(xué)指數(shù)調(diào)節(jié)卵巢功能。這些單味藥藥物成分和功效的實(shí)驗(yàn)研究均為通脈大生片治療排卵障礙型不孕提供了佐證。

FSHR屬于G蛋白偶聯(lián)型受體家族中的成員。FSH調(diào)節(jié)卵巢功能和卵泡發(fā)育功能的發(fā)揮必須通過卵巢顆粒細(xì)胞的FSHR所介導(dǎo)[8]。Abdennebi等人研究發(fā)現(xiàn)[9]，F(xiàn)SH的功能受FSHR表達(dá)數(shù)量或活性的調(diào)控。FSHR表達(dá)的增加可以改善卵巢對促性腺激素(Gn)的反應(yīng)性，使卵泡數(shù)目和血清雌二醇峰值增加，可能會取得更好的排卵效果[10-12]。因此FSHR表達(dá)量對卵泡的發(fā)育有重要的促進(jìn)作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究報道卵巢排卵功能受下丘腦-垂體-卵巢生殖軸的調(diào)控，但越來越多的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)卵巢排卵還受自分泌-旁分泌因子的微調(diào)節(jié)[13,14]。有研究認(rèn)為TGF-β超家族成員在卵泡發(fā)育的各個階段有重要的作用[15]。更有研究證實(shí)TGF-β參與卵巢顆粒細(xì)胞FSH受體表達(dá)的上調(diào)[16,17]。

課題前期實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)通脈大生片促卵泡發(fā)育和排卵的功效不僅調(diào)控下丘腦-垂體-卵巢生殖軸[18]有關(guān)，還與調(diào)控TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有相關(guān)性，對腎虛排卵障礙型不孕具有肯定的治療功效。研究結(jié)果顯示TGF-β1與其受體在通脈大生片灌胃后的大鼠中表達(dá)量均上調(diào)[19,20]。用通脈大生片灌胃后大鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)模型組卵巢數(shù)目少，卵巢顆粒細(xì)胞稀疏，層次明顯減少，大量閉鎖卵泡和原始卵泡存在。而通脈大生片高、中、低劑量組卵巢卵泡顆粒細(xì)胞較模型組致密增厚，層次明顯，有成熟卵泡形成。并且通脈大生片各劑量組血清FSH、LH數(shù)目也較模型組增多，表明通脈大生片可通過提高FSH、LH的分泌，調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和卵巢排卵功能。

本實(shí)驗(yàn)選用丙酸睪酮復(fù)制腎虛排卵障礙型不孕模型。注射丙酸睪酮后的大鼠不僅出現(xiàn)陰道脫落細(xì)胞的病理改變，而且還表現(xiàn)出脫毛，驚恐易激惹行為。中醫(yī)認(rèn)為腎其華在發(fā)，在志為恐。腎精充，則毛發(fā)榮，情志和。腎精虧虛，則毛發(fā)枯槁，因虛致恐。中醫(yī)理論在模型大鼠癥狀表現(xiàn)中得到印證，為中醫(yī)科學(xué)化提供了研究思路。病、證結(jié)合是研制中醫(yī)疾病、病理模型的最佳途徑。丙酸睪酮制備的腎虛排卵障礙型不孕模型不僅排卵障礙的指標(biāo)變化，還有“腎虛”體征。該模型是既與中醫(yī)基礎(chǔ)理論相吻合，又與中醫(yī)臨床實(shí)踐相吻合的實(shí)用性動物模型，“病”、“證”結(jié)合，科學(xué)規(guī)范。

在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)用通脈大生片灌胃后的卵巢FSHR的表達(dá)量明顯上調(diào)，大鼠卵巢重量也明顯較模型組增加，卵巢FSHR mRNA的表達(dá)量與卵巢指數(shù)之間存在一定的相關(guān)性，表明通脈大生片可提高卵巢組織FSHR mRNA的表達(dá)量，提高卵巢對FSH的反應(yīng)敏感性，從而促進(jìn)卵泡的發(fā)育和卵子的排出。因此，本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，通脈大生片促進(jìn)腎虛ASR大鼠的卵泡發(fā)育及排卵的機(jī)制可能與通過上調(diào)卵巢局部FSHR mRNA的表達(dá)，提高卵巢對FSH反應(yīng)性有關(guān)，為補(bǔ)腎調(diào)沖法治療腎虛排卵障礙型不孕提供了科學(xué)依據(jù)。至于FSHR mRNA表達(dá)的上調(diào)是否基于TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)有待后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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