★ 黃丹娥 崔景朝 付建武 張建軍 曾曉會(huì) 黃雪君 姚楠

(廣東省中醫(yī)研究所 廣東 廣州 510095)

姜黃素具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、改善心血管功能、抗炎、抗病毒、保肝、增強(qiáng)免疫力等，具有良好的藥理活性和應(yīng)用前景[1]，但是姜黃素存在疏水性強(qiáng)、口服吸收少、穩(wěn)定性差以及體內(nèi)生物利用度低等缺陷，很大程度上影響了其在臨床上的使用[2]。

研究表明胡椒堿可提高動(dòng)物和人血清姜黃素含量和生物利用度，主要是因?yàn)楹穳A為體內(nèi)葡萄糖醛酸酶抑制劑，可降低姜黃素的代謝[3]。

脂質(zhì)立方液晶的處方比例不僅能夠影響立方液晶本身的物理化學(xué)性質(zhì)，而且對(duì)自身的結(jié)構(gòu)、晶型以及藥物的包封率和載藥量也具有重要的意義。針對(duì)姜黃素在水中溶解度低、穩(wěn)定性較差、生物利用度低等問(wèn)題，將姜黃素與胡椒堿進(jìn)行配伍，制備姜黃素脂質(zhì)體立方液晶制劑。為了保證脂質(zhì)立方相晶體結(jié)構(gòu)以及提高藥物的包封率和載藥量，本論文對(duì)復(fù)方姜黃素脂質(zhì)立方液晶處方工藝進(jìn)行了摸索。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent1200高效液相色譜儀(G1312A型二元泵，G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，G1314B型VWD檢測(cè)器，美國(guó))；Kromasil-C18柱(4.6mm×250 mm，5μm，瑞典EKA Chemicals公司)；XS205DU型1/10萬(wàn)電子分析天平(METTLER TOLEDO)；5424型小型高速離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司)；恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；20～200μL移液槍(BIOHIT)；36MM透析袋(BIOSHARP，USA)；milli-Q advantage超純水器(密理博中國(guó)有限公司)；kel-2000b實(shí)驗(yàn)室高精度顯微加熱臺(tái)(南京凱爾儀器有限公司)；BX41-P偏光顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；Q500超聲波破碎儀(美國(guó)Misonix公司)；LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HJ-4A型數(shù)顯恒溫多頭強(qiáng)力磁力攪拌器(金壇市順華儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑 姜黃素(四川金郁金科技開(kāi)發(fā)有限公司，純度98%)；胡椒堿(海南尊鰲科技開(kāi)發(fā)有限公司，純度95%)；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110823-201004，純度98.8%)；胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110775-201104，純度99.2%)；植烷三醇(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，純度>98%)；甘油單油酸酯(美國(guó)Amresco有限公司，純度99%)；維他命E乙酸酯(購(gòu)自于美國(guó)sigma公司，純度99%)；Lutrol F127(巴斯夫中國(guó)有限公司)；葡聚糖凝膠G-50(AR，上海雅吉生物科技有限公司)；36 mm透析袋(美國(guó)Biosharp公司)；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素考察

2.1.1 植烷三醇用量考察 準(zhǔn)確稱取0.1g，0.2g和0.3g Phytantriol脂質(zhì)材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無(wú)水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.04g F127于100mL燒杯中，加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細(xì)胞超聲儀上超聲5min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復(fù)方姜黃素立方液晶混懸液。將上述混懸液分別定容至25mL，精密吸取0.1mL至5mL的量瓶中，加入甲醇適量，超聲15min，冷卻至室溫，加入甲醇稀釋并定容至刻度；精密量取上述溶液100μL，加入微型凝膠柱(徑高比1∶6)上表面，離心。采用相同體積的蒸餾水重復(fù)洗脫6次，收集合并洗脫液，加入甲醇適量超聲15min，冷卻至室溫，加入甲醇稀釋并定容至5mL，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，測(cè)定液晶樣品中姜黃素和胡椒堿的包封率。同時(shí)精密量取復(fù)方姜黃素脂質(zhì)立方液晶混懸液10mL于已恒重的蒸發(fā)皿中，減壓冷凍干燥至恒重，稱定重量，計(jì)算姜黃素和胡椒堿的載藥量，結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1 植烷三醇不同用量考察

由上表結(jié)果可知，不同的植烷三醇用量對(duì)姜黃素和胡椒堿的包封率無(wú)明顯影響，同時(shí)載藥量隨著植烷三醇用量的增加而逐漸減小，說(shuō)明植烷三醇已充分參與了脂質(zhì)立方液晶結(jié)構(gòu)的組裝。隨著植烷三醇用量的增加，并沒(méi)有顯著提高藥物的包封率，相反降低了立方液晶載藥量，故確定植烷三醇用量為0.1g。

2.1.2 穩(wěn)定劑種類考察 依據(jù)文獻(xiàn)，選擇F127[4]和Vitamin E Acetate[5]作為植烷三醇/水體系脂質(zhì)立方液晶穩(wěn)定劑。通過(guò)對(duì)比F127和Vitamin E Acetate兩種穩(wěn)定劑，考察其對(duì)姜黃素和胡椒堿包封率和載藥量的影響。

Phytantriol/F127/water體系的制備：稱取0.1g Phytantriol脂質(zhì)材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無(wú)水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.02g F127于100mL燒杯中，加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細(xì)胞超聲儀上超聲5min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復(fù)方姜黃素立方液晶混懸液，按照上述測(cè)定方法計(jì)算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量。

Phytantriol/Vitamin E Acetate/water體系的制備：稱取0.1g Phytantriol脂質(zhì)材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無(wú)水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.02g Vitamin E Acetate于100mL燒杯中，加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細(xì)胞超聲儀上超聲5min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復(fù)方姜黃素立方液晶混懸液，按照上述測(cè)定方法計(jì)算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同穩(wěn)定劑種類的考察

由結(jié)果可知，不同的穩(wěn)定劑種類對(duì)胡椒堿包封率無(wú)顯著性差異，對(duì)姜黃素具有較強(qiáng)的選擇性，這可能與藥物和穩(wěn)定劑之間的相互作用有關(guān)，本試驗(yàn)選擇F127作為復(fù)方姜黃素脂質(zhì)立方液晶穩(wěn)定劑。

2.1.3 F127用量考察 稱取0.1g Phytantriol脂質(zhì)材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無(wú)水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；分別稱取相當(dāng)于植烷三醇質(zhì)量5%、10%、20%、30%和40%的F127于100mL的燒杯中，加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細(xì)胞超聲儀上超聲5min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復(fù)方姜黃素立方液晶混懸液。按照上述測(cè)定方法計(jì)算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 F127不同用量的考察

由上表結(jié)果可以看出，隨著F127用量的增加，姜黃素和胡椒堿包封率和載藥量呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)。說(shuō)明F127在一定范圍內(nèi)可以參與脂質(zhì)立方液晶結(jié)構(gòu)的組裝并能支撐整個(gè)骨架，但是當(dāng)用量超過(guò)30%，其又可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的破壞或者晶型結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致包封率和載藥量的下降。

2.1.4 分散相用量考察 稱取0.1g Phytantriol脂質(zhì)材料于西林瓶中，加入一定量的姜黃素和胡椒堿無(wú)水乙醇溶液超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.02g F127于100mL燒杯中，分別加入5mL，10mL，20mL和30mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細(xì)胞超聲儀上超聲5 min(超聲功率為300W，5s/次，間隔5 s)，即得大小均一的復(fù)方姜黃素立方液晶混懸液。按照上述測(cè)定方法計(jì)算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量，結(jié)果見(jiàn)下表4。

表4 不同分散相量的考察

由結(jié)果可知，分散相用量在一定范圍內(nèi)對(duì)復(fù)方姜黃素脂質(zhì)立方液晶具有顯著性影響。分散相用量較少，脂質(zhì)立方液晶納米粒濃度較高，樣品易于聚集，穩(wěn)定性下降。當(dāng)分散相用量超過(guò)10mL，胡椒堿和姜黃素包封率和載藥量均趨于穩(wěn)定。

2.1.5 藥物用量 稱取0.1g Phytantriol脂質(zhì)材料于西林瓶中，加入相當(dāng)于植烷三醇質(zhì)量的3%，5%，7%和10%的姜黃素和胡椒堿(質(zhì)量比為3∶1)無(wú)水乙醇溶液，超聲30min，使其充分溶解，作為A相；稱取0.02g F127于100mL燒杯中，分別加入20mL的蒸餾水，于水浴60℃上加熱使溶解，混合均勻，作為B相。將A相緩慢滴加至B相中，攪拌3h，再于細(xì)胞超聲儀上超

聲5min(超聲功率：300W，5s/次，間隔5s)，即得大小均一的復(fù)方姜黃素立方液晶混懸液。按照上述測(cè)定方法計(jì)算姜黃素和胡椒堿的包封率和載藥量。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同藥物用量的考察

隨著藥物用量的增加，胡椒堿和姜黃素包封率、載藥量均有一定的提高，但當(dāng)投藥量達(dá)到10%，姜黃素包封率和載藥量顯著下降，說(shuō)明藥物用量過(guò)高會(huì)對(duì)脂質(zhì)立方液晶的脂質(zhì)雙分子層造成影響，同時(shí)過(guò)高的藥物濃度也可能使得納米粒的晶型結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

2.2 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇影響姜黃素和胡椒堿包封率較大的三個(gè)因素：藥量、F127用量以及分散相用量。固定植烷三醇用量為0.1g，選取藥量、F127用量以及分散相用量三個(gè)因素三個(gè)水平，采用U8(83)均勻設(shè)計(jì)表，以復(fù)方姜黃素的包封率和載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分，優(yōu)化復(fù)方姜黃素脂質(zhì)立方液晶最佳處方工藝。因素水平表見(jiàn)表6。

表6 因素水平表

根據(jù)U8(83)均勻設(shè)計(jì)表，將前面各因素的水平數(shù)進(jìn)行合并{1,2}=1，{3,4}=2，{5,6}=3，{7,8}=4;將第4列的水平合并為四水平，試驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排表

綜合評(píng)分=胡椒堿包封率/胡椒堿包封率max×0.25+姜黃素包封率/姜黃素包封率max×0.25+胡椒堿載藥量/胡椒堿載藥量max×0.25+姜黃素載藥量/姜黃素載藥量max×0.25。

2.2.1 回歸模型及檢驗(yàn) 應(yīng)用DPS 6.55軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，剔除影響較小的因素，結(jié)果顯示，二次項(xiàng)模型所擬合方程意義顯著(結(jié)果見(jiàn)表8)，所得回歸方程分別為：

Y=3.4452-27.9301X1-26.6210X2+166.785 9X1X2+51.182 0X22

其中X1為藥量(%)，X2為F127用量(%)，X3為分散相用量(g)，Y為復(fù)方姜黃素包封率和載藥量的綜合評(píng)分。

表8 回歸模型方差分析表

通過(guò)分析各自變量與因變量之間的關(guān)系(如圖1)，可以看出X1(藥量)與綜合評(píng)分呈現(xiàn)正相關(guān)，X2(F127用量)與綜合評(píng)分呈現(xiàn)曲線相關(guān)，X3(加水量)與綜合評(píng)分無(wú)相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明F127和藥物用量(藥輔比)是影響復(fù)方姜黃素包封率和載藥量的主要因素；分散相用量對(duì)復(fù)方姜黃素包封率和載藥量影響不顯著，只改變藥物的分散濃度。

X1：藥量；X2：F127用量；X3：分散相用量

圖2 藥量與F127用量與綜合評(píng)分的三維效應(yīng)面圖

圖3 藥量與分散相用量對(duì)綜合評(píng)分的三維效應(yīng)面圖

2.2.2 效應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程，選擇兩個(gè)不同的自變量和因變量做三維效應(yīng)面圖(如圖2～4)，由圖可知，隨著藥量的增加，復(fù)方姜黃素包封率和載藥量呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)，說(shuō)明在一定的范圍內(nèi)，隨著藥量的增加，脂質(zhì)立方液晶的包封率和載藥量隨之增加；而分散相用量對(duì)綜合評(píng)分影響不顯著，說(shuō)明分散相用量只是影響藥物的濃度，不影響藥物的包封率和載藥量；F127用量對(duì)復(fù)方姜黃素包封率和載藥量影響較為顯著，呈現(xiàn)二次項(xiàng)關(guān)系，這主要是因?yàn)镕127參與脂質(zhì)立方液晶結(jié)構(gòu)的組裝和支撐，在一定的范圍內(nèi)增加F127用量，有利于脂質(zhì)立方液晶結(jié)構(gòu)的形成和骨架的支撐，但當(dāng)用量過(guò)高，反而不利于納米結(jié)構(gòu)的形成和藥物的包封。

圖4 分散相用量與F127對(duì)綜合評(píng)分的三維效應(yīng)面圖

2.2.3 效應(yīng)值優(yōu)化及驗(yàn)證 結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，軟件系統(tǒng)給出最高評(píng)分時(shí)各個(gè)因素組合：植烷三醇0.1g，藥量為8mg，F(xiàn)127用量為25mg，分散相用量20g。按優(yōu)選的最佳處方工藝，進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算綜合評(píng)分。結(jié)果見(jiàn)表9。由表結(jié)果可知，驗(yàn)證三批試驗(yàn)結(jié)果相差較小，胡椒堿和姜黃素的包封率均在70%以上，胡椒堿和姜黃素載藥量分別在0.5%和2%以上。

表9 處方工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

篩選了輔料的用量、穩(wěn)定劑的種類和用量、分散體系用量以及藥物用量對(duì)姜黃素和胡椒堿包封率和載藥量的影響，并采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝，得到復(fù)方姜黃素脂質(zhì)立方液晶最佳制備處方，即：植烷三醇0.1g，藥量為8mg，F(xiàn)127用量為25mg，加水量20g。制得的復(fù)方姜黃素脂質(zhì)立方液晶納米粒姜黃素包封率達(dá)到了70%以上，載藥量達(dá)到了2.5%；胡椒堿包封率達(dá)到了75%以上，載藥量達(dá)到了0.8%以上，滿足了實(shí)驗(yàn)要求。

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