★ 張凌 劉長安 李文宏 柳芳林 翟興英 金晨 楊世林

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江西 南昌 330004)

中藥“十八反”是基于中藥配伍理論藥性相反或相制的代表性組合，是在特定生理狀態(tài)-中藥配伍-劑量-物質(zhì)成分變化產(chǎn)生的毒效表征，反藥組合配伍后致毒、增毒特點(diǎn)及其毒性表征是亟待解決的科學(xué)問題。草烏為毛茛科植物北烏頭aconitum kusnezoffii Reichb的干燥塊根，具有辛，苦，熱，有大毒，主治祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛，常用于風(fēng)寒濕痹，關(guān)節(jié)疼痛，心腹冷痛等[1]，研究表明草烏中的雙酯型生物堿對(duì)心臟具有明顯毒害作用[2]。草烏在是“十八反”中“半蔞貝蘞及攻烏”有配伍禁忌關(guān)系，課題組在前期草烏、草烏與瓜蔞和草烏與白及配伍小鼠體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，草烏與瓜蔞、白及配伍后有明顯毒性增強(qiáng)的趨勢，而對(duì)配伍后相關(guān)作用機(jī)制研究報(bào)道很少。體外細(xì)胞培養(yǎng)具有可以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)，且能避免體內(nèi)環(huán)境干擾等優(yōu)勢[3]。本實(shí)驗(yàn)選用體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法研究草烏、草烏與瓜蔞和草烏與白及配伍后對(duì)心肌細(xì)胞毒性作用同時(shí)探討增毒作用機(jī)制，為“十八反”中藥配伍禁忌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 藥材 草烏(批號(hào)120701)購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司；瓜蔞(批號(hào)210191)、白及(批號(hào)205291)均購自北京華邈中藥技術(shù)開發(fā)中心。經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鄧可眾副教授鑒定，草烏為毛茛科植物北烏頭AconitumkusnezoffiiReichb的干燥塊根，瓜蔞為葫蘆科植物TrichosantheskirilowiiMaxim的干燥成熟果實(shí)，白及為蘭科植物Bletillastriata(Thunb.)reichb.f.的干燥塊莖。

1.2 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞H9c2(2-1)，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 試劑 胎牛血清(Gibco公司)；MTT粉末(sigma公司)；DMSO溶液(Solarbio公司)；乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；超微量Na+-K+-ATP酶測試盒(南京建成生物工程研究所)；Annein Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貝博生物有限公司)；

1.4 儀器 CO2孵化箱(SANYO公司)ELx800酶標(biāo)儀(Biotek公司)；FC500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)；D-37520高速離心機(jī)(Thermo公司)；AB104-N電子分析天平(梅特勒-托力多(上海)有限公司)；100級(jí)超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠)；-80℃低溫冰箱(Thermo公司)。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立 在經(jīng)過紫外照射30min的超凈工作臺(tái)中，將大鼠心肌細(xì)胞，吸除原培養(yǎng)液，用1mL胰酶，消化30s，加入3mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中止消化，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從瓶壁洗脫下來，再將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，放置37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大約48h換一次培養(yǎng)液，等到細(xì)胞長滿后，凍存，傳代，為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

2.2 細(xì)胞存活率測定 將心肌細(xì)胞懸液密度為1×105的細(xì)胞接種到96孔板上，設(shè)10組，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，換無血清的培養(yǎng)基12h后，分別加不同藥物不同濃度的大鼠血清的9個(gè)組(草烏、草烏+瓜蔞、草烏+白及各3個(gè)大鼠血清濃度)，正常組加入等量的空白血清，作用60min后，每孔加20μLMTT(5mg/mL)，37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，吸除各孔溶液，每孔加入150μLDMSO溶液，置搖床低速振蕩10min，使沉淀物甲瓚充分溶解，在酶標(biāo)儀波長490nm處測定各孔的OD值。

2.3 LDH測定 將心肌細(xì)胞懸液密度為1×105的細(xì)胞接種到96孔板上，設(shè)10組，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，換無血清的培養(yǎng)基12h后，分別加不同藥物不同濃度的大鼠血清9個(gè)組(同上)，正常組加入等量的空白血清，作用60min后，取上清液按照試劑盒要求進(jìn)行測定。

2.4 Na+-K+-ATP酶活性測定 將心肌細(xì)胞懸液接種到6孔板上，接種10組，置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，換無血清的培養(yǎng)基12h后，加不同藥物不同濃度的大鼠血清(同上)，正常組加空白血清，作用60min后，將細(xì)胞消化，離心，去除上清液，每管加入0.2～0.3mL生理鹽水制備成107/cm3的細(xì)胞懸液，用勻漿器破碎，按照試劑盒要求進(jìn)行測定。

2.5 Na+-K+-ATP酶含量測定 將心肌細(xì)胞懸液接種到6孔板中，接種10組，置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，換無血清的培養(yǎng)基12h后，加不同藥物不同濃度的大鼠血清(同上)，正常組加空白血清，作用60min后，用胰酶消化，離心，除去上清液，將收集好的細(xì)胞加入300～500μL熱雙蒸水，置于熱水浴(90～100℃)中勻漿破碎，再將細(xì)胞懸液置于沸水中加熱10min，取出渦旋混勻1min，按照試劑盒要求進(jìn)行測定。

2.6 細(xì)胞凋亡率的測定 將心肌細(xì)胞懸液接種到6孔板中，置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，換無血清的培養(yǎng)基12h后，加不同藥物不同濃度的大鼠血清(同上)，正常組加入等量的空白血清，作用60min后，進(jìn)行染色，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果

3.1 心肌細(xì)胞存活率測定結(jié)果 和對(duì)照組相比，不同濃度大鼠血清給藥組的OD值均有明顯降低，與同濃度單獨(dú)草烏組比較，草烏與瓜蔞、白及配伍后OD值低于單獨(dú)草烏組，說明配伍后毒性強(qiáng)于單獨(dú)草烏組，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05),見表1。

表1 不同濃度含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞活力的比較

注：和正常組相比，*P<0.05；和同濃度單獨(dú)草烏組相比，ΔP<0.05。

表2 不同給藥組與對(duì)照組對(duì)心肌細(xì)胞LDH的比較

注：和正常組相比，*P<0.05。

3.2 LDH測定結(jié)果 不同濃度大鼠血清給藥組的LDH均有明顯上升，和正常組相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)，見表2。

表3 不同給藥組與正常組對(duì)心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP活力的比較

注：和正常組相比，*P<0.05。

表4 不同給藥組與對(duì)照組對(duì)心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶含量的比較

注：和正常組相比，*P<0.05。

表5 細(xì)胞凋亡率的測定結(jié)果

注：和正常組相比，*P<0.05。

3.3 Na+-K+-ATP酶活性的測定結(jié)果 不同濃度大鼠血清給藥組能明顯抑制Na+-K+-ATP酶活性，和正常組相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)，見表3。

3.4 Na+-K+-ATP酶含量測定結(jié)果 給藥各組中ATP酶濃度都出現(xiàn)不同程度的下降，與正常組相比，不同給藥組的細(xì)胞中的ATP濃度有顯著性差異(P<0.05)，見表4。

3.5 細(xì)胞凋亡率的測定結(jié)果 隨著血清濃度的提高，給藥組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，與正常組相比，8%，16%大鼠血清給藥組細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(P<0.05)，見表5。

4 討論

中藥相反是指兩種藥物合用，可能產(chǎn)生毒性、副作用或療效降低?！安轂醴垂鲜V”、“草烏反白及”屬中藥十八反范疇,中醫(yī)將其視為配伍禁忌。本研究從草烏類中毒報(bào)道中心動(dòng)過緩為主要表現(xiàn)[4]，毒性主要靶器官心臟入手，觀察心肌細(xì)胞存活率研究其對(duì)心肌細(xì)胞毒性大小，從細(xì)胞膜通透性，Na+-K+-ATP酶活性，ATP酶含量以及細(xì)胞凋亡率4個(gè)指標(biāo)研究其增毒作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較不同濃度含藥血清對(duì)心肌細(xì)胞均有不同程度毒害作用，同濃度含藥血清中，草烏與瓜蔞、草烏與白及配伍后，毒性強(qiáng)于草烏組，表明草烏與瓜蔞、白及配伍后毒性增加。從細(xì)胞外LDH含量上升，說明草烏與配伍組增大了細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的紊亂；抑制心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶活性、降低其含量，導(dǎo)致細(xì)胞功能系統(tǒng)異常，加速細(xì)胞的死亡，結(jié)果與文獻(xiàn)[5]相似。此外，在凋亡率測定中，當(dāng)血清濃度達(dá)到8%時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯上升，表明達(dá)到一定閾值時(shí)，草烏及配伍組會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞自身凋亡，從而加速細(xì)胞死亡。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：220.

[2]侯敏，石文宏，盛惟，等.草烏不同炮制方法與急性毒性的相關(guān)性研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2011，8(8)：30-31.

[3]王衍堂.生草烏水提液心臟毒性體內(nèi)外試驗(yàn)研究[D].成都：四川大學(xué)，2007.

[4]郭見恩，樊金銘，等.生川烏配伍全瓜蔞對(duì)小鼠急性毒性的影響[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012,29(4)：349-351.

[5]尹航.川烏配伍瓜蔞藥效學(xué)及毒性研究[D].長春：中醫(yī)藥大學(xué)，2011:1-3.