李建強(qiáng) 張宏蕊 石曉明 呂柏楠

·論著·

水通道蛋白-8對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及凋亡抑制蛋白的影響

李建強(qiáng) 張宏蕊 石曉明 呂柏楠

目的通過表達(dá)水通道蛋白-8(AQP-8)真核表達(dá)載體，觀察水通道蛋白AQP-8對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡及凋亡抑制蛋白(IAPs)表達(dá)的影響。方法取對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株用于實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建AQP-8真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞，通過Western blot檢測GFP-AQP-8轉(zhuǎn)染效率；采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；通過Real Time-PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染GFP-AQP-8的HT-29細(xì)胞凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成員c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin和Livin表達(dá)水平。結(jié)果Western blot結(jié)果顯示，GFP-AQP-8轉(zhuǎn)染后結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞AQP-8基因表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。MTT分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了GFP-AQP-8的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)；流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了GFP-AQP-8的HT-29細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。Real Time-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染GFP-N1的陰性對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染了GFP-AQP-8的HT-29細(xì)胞c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，NIAP表達(dá)變化不明顯(P<0.05)。結(jié)論過表達(dá)AQP-8可抑制HT-29細(xì)胞生長，并能通過下調(diào)c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin表達(dá)誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡。

水通道蛋白-8；結(jié)腸腫瘤；凋亡；凋亡抑制蛋白

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)惡性腫瘤死因中，其病死率居第二位[1]。結(jié)腸癌易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)往往導(dǎo)致治療效果不佳。而在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的代謝與營養(yǎng)交換離不開水分子的參與。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一類廣泛存在于細(xì)胞膜上的、具有高選擇性的、特異轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的通道[2]。研究顯示，水通道蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[3]，其中包括對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響[4]。細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitaors of apoptosis proteins,IAPs)是一類重要的凋亡抑制因子，參與了多種細(xì)胞的凋亡調(diào)控。本文通過體外過表達(dá)AQP-8，觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及IAPs家族成員表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 結(jié)腸中分化腺癌細(xì)胞株HT-29，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。MTT，美國Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)液、胰蛋白酶，Gibco公司；熒光定量RT-PCR試劑盒，美國Promega公司；ABI 7500 PCR儀，美國ABI公司；AQP-5、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin及GAPDH抗體，美國Santa Cruz公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；FASCalibur流式細(xì)胞儀，BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人HT-29細(xì)胞于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。用0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 GFP-AQP-8轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組：用軟件設(shè)計(jì)AQP-8基因特異性引物，提取HT-29細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR法擴(kuò)增AQP-8基因，與質(zhì)粒載體GFP-N1進(jìn)行酶切、鏈接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定并測序。轉(zhuǎn)染前24 h于6孔板中接種HT-29細(xì)胞，密度為4×106個(gè)/ml。轉(zhuǎn)染前用無血清無抗生素的DMEM/F12清洗細(xì)胞，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)法，按照試劑說明書用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000將GFP-AQP-8或?qū)φ召|(zhì)粒GFP-N1轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，檢測轉(zhuǎn)染效率及PCNA和P53表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組為：正常對(duì)照組、GFP-N1空載體組和GFP-AQP-8組。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖率：對(duì)數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)溶液消化并接種于96孔板，接種密度為5×104個(gè)/ml，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，室溫振蕩15 min至結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀于波長490 nm測吸光度OD值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。增殖抑制率(%)=(1-試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：用0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，4℃，500 g離心，去上清，沉淀中加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打，4℃固定過夜。4℃，500 g，離心10 min，去上清，用1×PBS清洗2次。加入1 ml PI染液將細(xì)胞重懸，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 RNA提取及Real Time-PCR：收集細(xì)胞，按照Invitrogen公司Trizol試劑的產(chǎn)品說明書要求，采用一步法提取RNA。測定RNA純度和濃度，并經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性后，各組都取1 μg RNA，按試劑盒說明書要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 5 min預(yù)變性后，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的延伸階段采集熒光信號(hào)。擴(kuò)增結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參照基因，計(jì)算目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)及以此為依據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所用引物序列為如下：c-IAP1上游引物：5’-GAAGACATCTCTTCATCGAGG-3’，下游引物：5’-CCACAGGTGTATTCATCATGAC-3’c-IAP2上游引物：5’-TCCTAGCTGCAGATTCGTTC -3’，下游引物：5’-GGTAACTGGCTTGAACTTGAC-3’。XIAP上游引物：5’-GCACGAGCAGGGTTTCTTTATACTGGTG-3’，下游引物：5’-CTTCTTCACAATACATGGCAGGGTTCCTC-3’。NIAP上游引物：5’-CTGGGCCTAGATGCAGTTCAG -3’，下游引物：5’-ACGGCTCATAAGTCACAAAAGTC-3’。Survivin上游引物：5’-CTTTCTCAAGGACCACCGCA-3’，下游引物5’-GCCTCGGCCATCCGCT-3’。Livin上游引物：5’-AGTTCCTGCTCCGGTCAAAA-3’，下游引物5’-GCTGCGTCTTCCGGTTCTT-3’。GAPDH上游引物：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。

1.2.6 Western blot法檢測目的蛋白質(zhì)表達(dá)：收集細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗滌3次，于細(xì)胞裂解液中重懸細(xì)胞，冰上裂解間斷渦旋30 min后，4℃，8 000 r/min離心10 min，上清即為細(xì)胞總蛋白。用改良的Lowry法定量后，各組取等量的蛋白依次經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、電轉(zhuǎn)移至PVDF膜、5%脫脂奶粉室溫封閉后，分別用稀釋后的AQP-8、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin及GAPDH一抗4℃孵育過夜，TTBS于室溫?fù)u床振搖漂洗三次后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，對(duì)條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。用各蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 AQP-8真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率的鑒定 Western-blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了GFP-N1空載體組的對(duì)照細(xì)胞中AQP-8表達(dá)非常低，而轉(zhuǎn)染了GFP-AQP-8的HT-29細(xì)胞AQP-8的表達(dá)顯著上調(diào)，表明GFP-AQP-8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后能高效表達(dá)AQP-8，而轉(zhuǎn)染GFP-N1空載體的陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組的細(xì)胞相比，AQP-8的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

A

B

2.2 轉(zhuǎn)染GFP-AQP-8對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測轉(zhuǎn)染GFP-AQP-8對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染和GFP-N1的陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了GFP-AQP-8的HT-29細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)，提示上調(diào)AQP-8的表達(dá)可抑制HT-29細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)染GFP-N1空載體的陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組的細(xì)胞相比，增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 轉(zhuǎn)染GFP-AQP-8對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染GFP-AQP-8對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染和GFP-N1的HT-29的陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了GFP-AQP-8的HT-29的細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，提示上調(diào)AQP-8的表達(dá)可促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染GFP-N1空載體的陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組的細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 HT-29細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率無變化 ±s

注：與GFP-N1組比較，*P<0.05

2.4 轉(zhuǎn)染GFP-AQP-8對(duì)HT-29細(xì)胞IAPs家族成員表達(dá)的影響 Real Time-PCR和Western blot分別檢測HT-29細(xì)胞IAPs家族成員c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染GFP-N1的陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了GFP-AQP-8的HT-29細(xì)胞c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，NIAP表達(dá)變化不明顯(P>0.05)，轉(zhuǎn)染GFP-N1空載體的陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，各因子表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖2～4。

圖2 3組c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin mRNA 表達(dá)的變化

圖3 3組c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin 蛋白 表達(dá)的變化

圖4 3組c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NIAP、Survivin、Livin 蛋白 表達(dá)的變化(Western blot)

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞內(nèi)正常的生理過程，可以消除機(jī)體內(nèi)有害細(xì)胞，防止細(xì)胞的過度增殖?？梢姡蛲鍪菣C(jī)體維持正常細(xì)胞功能的關(guān)鍵。而腫瘤的發(fā)生機(jī)制之一是細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致細(xì)胞的過度增生。近年來，一組廣泛存在于多種細(xì)胞內(nèi)、具有抑制凋亡作用，被稱為凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的一類內(nèi)源性凋亡抑制蛋白逐漸被關(guān)注。該家族成員具有結(jié)構(gòu)同源性，與腫瘤、神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，在人體內(nèi)的過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不足最終形成腫瘤。以IAPs為靶點(diǎn)的治療可為臨床腫瘤治療提供新思路。

水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是特異的轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的蛋白家族，主要功能是調(diào)節(jié)水進(jìn)出細(xì)胞。在腫瘤細(xì)胞的高代謝過程中，水通道蛋白發(fā)揮這重要的作用。已有研究表明，AQPs表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，通過直接或間接改變AQPs表達(dá)可影響凋亡過程[5,6]。

然而，AQPs家族成員的表達(dá)模式不盡相同，比如在結(jié)腸癌組織中， AQP-5表達(dá)上調(diào)，AQP-8表達(dá)下調(diào)[7]。此外，AQP-8在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)，在星形細(xì)胞瘤組織中AQP-8則高表達(dá)[8]。AQP-8在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)[9]，提示AQP-8在人結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程中可能發(fā)揮重要作用。目前，AQP-8 在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制研究相對(duì)較少。本研究通過體外過表達(dá)的方式，首次研究AQP-8對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡及IAPs表達(dá)的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AQP-8可抑制HT-29細(xì)胞生長，促進(jìn)其凋亡。細(xì)胞是否凋亡取決于促凋亡和抑凋亡蛋白之間的平衡，促凋亡蛋白表達(dá)增高和/或抑凋亡蛋白表達(dá)降低均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。IAPs 蛋白通過與執(zhí)行凋亡的酶類Caspase3/7/9結(jié)合，抑制其催化活性，阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程。本文明確了過表達(dá)AQP-8表達(dá)能促進(jìn)凋亡后，接著對(duì)IAPs家族蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。c-IAP1和c-IAP2可直接抑制Caspase的活性[10]。XIAP的作用廣泛、穩(wěn)定、高效，被認(rèn)為最有效的Caspase抑制劑[11]。NIAP結(jié)構(gòu)和功能與其他成員差別較大，大多關(guān)于NIAP的研究集中于神經(jīng)系統(tǒng)。不過，已有研究顯示，乳腺癌中NIAP高度表達(dá)，且與預(yù)后相關(guān)[12]。Livin高表達(dá)于多種腫瘤，可通過抑制Caspase和激活TAK1/JNK1通路抑制細(xì)胞凋亡[13]。Survivin也是作用較強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。我們的結(jié)果表明，過表達(dá)AQP-8不同程度下調(diào)了c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin的表達(dá)，但不影響NIAP表達(dá)，表明HT-29細(xì)胞中還存在其他分子調(diào)控IAPs家族成員的表達(dá)。

綜上所述，過表達(dá)AQP-8可能通過下調(diào)c-IAP1、c-IAP1、XIAP、Livin和Survivin表達(dá)誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡，本研究為AQPs對(duì)結(jié)腸癌的作用研究及靶向性治療提供了新的依據(jù)。

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本刊編輯部

EffectofAQP-8oncellapoptosisandexpressionofIAPsinhumancoloncancerHT-29cellsinvitro

LIJianqiang*,ZHANGHongrui*,SHIXiaoming,etal.

*DepartmentofSurgery,XinleSocialInsuranceWorkers’Hospital,Hebei,Xinle050700,China

ObjectiveTo investigate the effects of aquaporin-8 (AQP-8) on cell apoptosis and expression of inhibitors of apoptosis proteins(IAPs) by means of eukaryotic expression vector that expresses AQP-8 in human colon cancer HT-29 cells in vitro.MethodsHuman colon cancer HT-29 cells at logarithm growth period were used in the experiment.AQP-8 eukaryotic expression vector was constructed and transfected into HT-29 cells.Western Blot was used to detect the transfection efficiency;MTT assay was used to detect the cell growth inhibition rate;flow cytometry(FCM) was used to measure the cell apoptosis rate.The expression levels of mRNA and protein of IAPs including c-IAP1,c-IAP2,XIAP,NIAP,Survivin and Livin were detected by fluorescence quantitative Real-time RT-PCR and Western Blot.ResultsThe results by Western Blot showed that the expression levels of AQP-8 were significantly up-regulated in colon cancer HT-29 cells after GFP-AQP-8 transfection (P<0.05).MTT analysis showed that the proliferation inhibition rate was increased significantly in HT-29 cells after GFP-AQP-8 transfection,as compared with that in GFP-N1 control group (P<0.05).FCM analysis showed that GFP-AQP-8 transfection obviously induced HT-29 cell apoptosis (P<0.05).The results of fluorescence Real-time quantitative RT-PCR and Western Blot showed that the expression levels of mRNA and protein of c-IAP1,c-IAP1,XIAP,Livin,and survivin in HT-29 cells were significantly decreased by AQP-8 overexpression (P<0.05).However,the expression levels of NIAP mRNA and protein had no obvious change (P>0.05).ConclusionThe overexpression of AQP-8 can inhibit growth of HT-29 cell and can induce HT-29 cell apoptosis by down-regulating the expression levels of c-IAP1,c-IAP1,XIAP,Livin and survivin.

aquaporin-8;colonic neoplasms;apoptosis;inhibitor of apoptosis proteins

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.22.005

050700 河北省新樂市社會(huì)保險(xiǎn)職工醫(yī)院外科(李建強(qiáng)、張宏蕊)；河北省人民醫(yī)院普外二科(石曉明、呂柏楠)

呂柏楠，050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院；

E-mail: shixiaoming1999@126.com

R 753.3+5

A

1002-7386(2014)22-3378-04

2014-05-15)