郝桂敏 崔娜 李學(xué)慧 李茜

·論著·

蛋白激酶C參與內(nèi)源性大麻素花生四烯乙醇胺對L型鈣電流的抑制作用

郝桂敏 崔娜 李學(xué)慧 李茜

目的研究內(nèi)源性大麻素物質(zhì)花生四烯乙醇胺是否通過改變蛋白激酶C(PKC)活性從而抑制心肌L型鈣電流，并進一步探討可能改變PKC活性的信號途徑。方法應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄單個心肌細胞的L型鈣電流(P<0.05)；應(yīng)用PepTag 非放射性蛋白激酶C檢測系統(tǒng)(Promega) 檢測PKC活性；Elisa試劑盒測定細胞中二脂酰甘油(DAG)的含量；western blot技術(shù)測定磷脂酶Cβ(PLCβ)和磷酸化磷脂酶Cβ(p-PLCβ)表達。結(jié)果應(yīng)用花生四烯乙醇胺灌流心肌細胞后顯著抑制心肌L型鈣電流(P<0.05)，預(yù)先應(yīng)用大麻素1型受體(CB1)阻斷劑AM251或PKC非特異性激動劑佛波醇酯(PMA)可以完全阻斷此抑制效應(yīng)，而大麻素2型受體(CB2)阻斷劑AM630沒有阻斷花生四烯乙醇胺抑制L型鈣電流的作用。檢測心肌細胞PKC活性發(fā)現(xiàn)，花生四烯乙醇胺明顯抑制PKC活性(P<0.05)，同樣預(yù)先應(yīng)用AM251 或PMA 完全阻斷花生四烯乙醇胺對PKC活性的抑制效應(yīng)，而AM630無此效應(yīng)。應(yīng)用花生四烯乙醇胺沒有影響心肌細胞DAG含量和PLCβ的磷酸化。結(jié)論本實驗首次證明內(nèi)源性大麻素花生四烯乙醇胺激活心肌細胞CB1受體后抑制細胞PKC的活性，從而抑制L型鈣電流，此過程沒有PLCβ-DAG途徑參與。

內(nèi)源性大麻素；內(nèi)源性大麻素受體；花生四烯乙醇胺；蛋白激酶C；L型鈣電流

近些年來，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)逐漸成為一些炎癥和組織損傷疾病的新型治療靶點。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)由特殊的大麻素受體、內(nèi)源性配體(內(nèi)源性大麻素)以及大麻素合成和滅活途徑共同組成；廣泛存在于身體的各種組織，包括心肌組織。到目前為止，在心肌組織中至少發(fā)現(xiàn)了兩種內(nèi)源性大麻素受體，1型受體(CB1)和2型受體(CB2)；兩種受體在心肌組織中可以發(fā)揮不同的作用[1]。我室前期研究表明，內(nèi)源性大麻素物質(zhì)花生四烯乙醇胺(anandamide)作用于心臟，具有明顯的抗心律失常效應(yīng)；進一步研究其電生理機制發(fā)現(xiàn)花生四烯乙醇胺作用于心肌細胞的CB1受體，加速心肌細胞L型鈣通道失活，減慢失活后復(fù)活，從而減少鈣內(nèi)流，縮短動作電位時程[2]。由此可知，當(dāng)心肌細胞上的內(nèi)源性大麻素CB1受體激活時，可以抑制L型鈣電流。心肌細胞的L型鈣通道無論是生理還是病理狀態(tài)，都發(fā)揮著極為重要的作用；其可受到多種機制的調(diào)節(jié)。大量報道表明，心肌細胞L型鈣通道是蛋白激酶C(PKC)的作用目標之一[3]。心肌中PKC活性的增加可以增加L型鈣電流[4]。內(nèi)源性大麻素花生四烯乙醇胺抑制L型鈣電流的信號途徑中是否有PKC的參與，到目前為止筆者尚未見報道。本實驗旨在研究花生四烯乙醇胺是否通過改變PKC活性從而抑制L型鈣電流，并進一步探討可能改變PKC活性的信號途徑。

1 材料與方法

1.1 大鼠心室肌細胞的分離 參照我室以前文獻[2]，取健康雄性大鼠，體重200～250 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。將大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，迅速開胸取出心臟，置于4℃臺氏液中，游離主動脈并逆行插管連接于Langendorff灌流裝置上，臺氏液4 ml/min流速連續(xù)灌流約5 min，洗去心臟殘血，然后用無鈣臺氏液灌流約10 min至心臟停搏后，用含300 mg/L膠原酶Ⅱ的無鈣臺氏液灌流分離大鼠單個心室肌細胞，消化約10 min后自左心室分段剪取心室肌組織，置于盛有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打，使之分散成單個細胞，置于4℃冰箱穩(wěn)定1 h待用。其中一部分細胞用于膜片鉗實驗，另一部分細胞用于其他實驗。

1.2 膜片鉗全細胞記錄 參照我室以前文獻[2]，在室溫下應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄單細胞離子電流。所用微電極用兩步拉制法拉制而成，制成的微電極充灌電極液后電阻2～4 MΩ。實驗過程由計算機軟件pCLAMP 10.0(AxonInstrument)控制數(shù)-模轉(zhuǎn)換器完成刺激信號的產(chǎn)生、反饋信號的采集以及數(shù)據(jù)分析。實驗時，將細胞懸液滴入浴槽中(容積1 ml)，靜置5～10 min待細胞貼壁后，用記錄L型鈣電流的細胞外液以1 ml/min恒速灌流。選擇橫紋清楚，邊緣整齊，表面光潔的桿狀心室肌細胞在電壓鉗模式進行刺激和記錄L型鈣電流。 封接和破膜時均進行電容電流補償，信號輸入經(jīng)過1 kHz的濾波，數(shù)據(jù)存于計算機以便分析。灌流過程中，細胞外液加入內(nèi)源性大麻素物質(zhì)花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)觀察L型鈣電流變化；應(yīng)用CB1受體阻斷劑AM251(100 nmol/L)，CB2受體阻斷劑AM630(100 nmol/L)或PKC非特異性激動劑PMA(500 nmol/L)首先灌流5 min后再加入花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)，觀察L型鈣電流變化。

1.3 PKC活性檢測 將上述分離的心肌細胞置于臺式液中，在臺式液中加入花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)孵育10 min；或用AM251(100 nmol/L)，AM630(100 nmol/L)或PMA(500 nmol/L)首先單獨孵育細胞5 min后再加入花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)共孵育10 min。將孵育好的心肌細胞取出，參照以前文獻[4]應(yīng)用PepTag 非放射性蛋白激酶C檢測系統(tǒng)(Promega) 檢測PKC活性。用PKC抽提液(25 mmol/L Tris.HCl pH=7.4，0.5 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA,0.05% Triton X-100，10 mmol/L beta-mercaptoethanol臨用時加1%蛋白酶抑制劑) 提取細胞蛋白，漩渦混合器上震蕩30 min后，在4℃，用14 000×g 離心5 min，保存上清。用纖維素柱純化PKC抽提液。按試劑盒說明書磷酸化反應(yīng)30 min，上樣電泳20 min。凝膠電泳后磷酸化和非磷酸化的底物肽C1被分開，磷酸化的底物帶負電荷向正極移動，非磷酸化的底物帶正電荷向負極移動，根據(jù)電泳后的條帶光密度值進行定性與定量分析。PKC活性單位定義為每分鐘每毫升蛋白溶液中使底物肽C1磷酸化的納摩爾數(shù)(nmol·min-1·ml-1)。計算方法見說明書。

1.4 二酰甘油(DAG)含量測定 將上述用不同藥物孵育后的細胞，應(yīng)用大鼠DAGElisa試劑盒測定細胞中DAG的含量。離心收集細胞，將其置于PBS溶液，超聲破碎后離心，取上清檢測。檢測步驟按試劑盒要求進行。

1.5 Western blot[5]取上述藥物孵育后的細胞，加入細胞裂解液，提取全細胞蛋白。BCA法進行蛋白定量。 蛋白上樣量50 μl,進行SDS-PAGE電泳,分離后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(anti-PLCβ和anti-P-PLCβ)，4℃孵育過夜，TBST漂洗，5 min×3次，加入二抗(堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG,1∶1 000稀釋)，室溫振蕩孵育2 h，TBST漂洗，ECL法顯色后，掃描條帶,將圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像，用Image J圖像分析軟件對蛋白條帶進行半定量分析，以P-PLCβ與總PLCβ灰度值比值表示P-PLCβ的相對表達水平。

1.6 試劑與溶液 內(nèi)源性大麻素花生四烯乙醇胺，CB1受體阻斷劑AM251和CB2受體阻斷劑AM630購自Enzo，PKC非特異性激動劑佛波醇酯(PMA)購自sigma，其余試劑均為國內(nèi)分析純。臺式液(mmol/L)：NaCl 136.8,KCl 5.4,MgCl21.05,CaCl21.08,NaHCO31.2,葡萄糖 11.0,and Tris 5.0 (pH值7.35～7.45,100%氧飽和)。無鈣臺式液(mmol/L)：NaCl 135,KCl 5.4,MgCl21.0,NaH2PO40.33,葡萄糖5,HEPES 10,用NaOH將pH值調(diào)至7.4。KB液(mmol/L)：KOH 80,KCl 40,NaH2PO425,MgSO43,谷氨酸50,牛磺酸 20,EGTA 1,HEPES 10,葡萄糖 10,用KOH將pH值調(diào)至7.4。細胞外液(mmol/L)：TEA-Cl 140,MgCl22.0,CaCl21.5,葡萄糖10,HEPES 10,TTX 10 μmol/L,100%氧飽和,用TEA-OH 將pH值調(diào)至7.3～7.4。電極內(nèi)液(mmol/L)：Mg-ATP 3,CsCl 140,HEPES 10,EGTA 2 mmol/L,用CsOH將pH值調(diào)至7.2。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)源性大麻素花生四烯乙醇胺對L型鈣通道電流-電壓(Ⅰ～Ⅴ)曲線的影響

2.1.1 在形成全細胞封接狀態(tài)后，將細胞鉗制在-40 mV，給予指令電位從-40～60 mV，躍階10 mV，波寬為1 000 ms的刺激。在細胞外液中給予花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)，灌流10 min，記錄電流變化，給藥濃度和記錄時間參照以前文獻[4]。與給藥前正常對照相比，應(yīng)用花生四烯乙醇胺可以使L型鈣電流的Ⅰ～Ⅴ曲線顯著上移(P<0.05)，沖洗后恢復(fù)正常。見表1、圖1。

2.1.2 應(yīng)用CB1受體阻斷劑AM251(100 nmol/L)或PKC非特異性激動劑PMA(500 nmol/L)首先灌流10 min，Ⅰ～Ⅴ曲線無明顯變化，之后再加入花生四烯乙醇胺灌流10 min，Ⅰ～Ⅴ曲線仍無明顯變化；應(yīng)用CB2受體阻斷劑AM630(100 nmol/L)首先灌流10 min，Ⅰ～Ⅴ曲線無明顯變化，之后再加入花生四烯乙醇胺灌流10 min，Ⅰ～Ⅴ曲線顯著上移(P<0.05)。AM251或PMA完全阻斷花生四烯乙醇胺對Ⅰ～Ⅴ曲線的抑制作用。見表1、圖2～4。

表1 8組Ⅰ～Ⅴ曲線峰值電流變化比較

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1 花生四烯乙醇胺(100nmol/L)對單個心室肌細胞L型鈣通道的影響。?P<0．05vs．對照組

圖2 內(nèi)源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(100nmol/L)，大麻素2型受體阻斷劑AM630(100nmol/L)

圖3 和蛋白激酶C非特異性激動劑佛波醇酯(500nmol/L)

2.2 內(nèi)源性大麻素花生四烯乙醇胺對心肌細胞PKC活性的影響 為了與記錄電流的時間對應(yīng)，實驗中用花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)孵育心肌細胞10 min。PKC發(fā)揮其酶活性，能使PKC特異的短肽底物PepTag C1短肽(帶正電荷)發(fā)生磷酸化變成磷酸化C1肽(帶負電荷)，從而通過電泳分開。花生四烯乙醇胺組與對照組相比，心肌細胞PKC活性明顯將低(P<0.05)；預(yù)先應(yīng)用AM251(100 nmol/L)或PMA(500 nmol/L)阻斷了花生四烯乙醇胺對PKC活性的抑制效應(yīng)，而AM630(100 nmol/L)沒有阻斷花生四烯乙醇胺的抑制效應(yīng)。見表2、圖5。

2.3 花生四烯乙醇胺對心肌細胞DAG含量的影響，以及對PLCβ和p-PLCβ表達量的影響 用花生四烯乙醇胺(100 nmol/L)孵育心肌細胞10 min，與對照組相比，花生四烯乙醇胺對DAG含量和PLCβ、p-PLCβ表達量沒有明顯影響。

表2 5組蛋白激酶C活性分析

注：與對照組比較，*P<0.05；與花生四烯酸乙醇胺組比較，#P<0.05

3 討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用內(nèi)源性大麻素花生四烯乙醇胺灌流心肌細胞后顯著抑制L型鈣電流，預(yù)先應(yīng)用CB1受體阻斷劑AM251或PKC非特異性激動劑PMA可以完全阻斷此抑制效應(yīng)，而CB2受體阻斷劑AM630并沒有阻斷花生四烯乙醇胺抑制L型鈣電流的效應(yīng)。檢測心肌細胞PKC活性發(fā)現(xiàn)，花生四烯乙醇胺明顯抑制PKC活性，同樣預(yù)先應(yīng)用AM251 或PMA 完全阻斷花生四烯乙醇胺對PKC活性的抑制效應(yīng)，AM630無阻斷效應(yīng)。應(yīng)用花生四烯乙醇胺沒有影響心肌細胞DAG含量和PLCβ的磷酸化。

我們以前研究表明，內(nèi)源性大麻素物質(zhì)花生四烯乙醇胺可以激活心肌細胞的CB1受體，從而加速心肌細胞L型鈣通道失活，減慢失活后復(fù)活，從而抑制鈣電流，縮短動作電位時程。本實驗應(yīng)用花生四烯乙醇胺同樣可以使L型鈣通道的Ⅰ～Ⅴ曲線明顯上移，抑制L型鈣電流，預(yù)先應(yīng)用CB1受體阻斷劑AM251而非CB2受體阻斷劑AM630可以阻斷此效應(yīng)，說明花生四烯乙醇胺激動CB1受體后抑制L型鈣電流，與以前報道相符。隨后我們進一步探討了激活CB1受體后導(dǎo)致L型鈣通道抑制的中間信號物質(zhì)。PKC是廣泛存在于人體組織細胞內(nèi)的一組絲/蘇氨酸蛋白激酶，為細胞信號傳導(dǎo)通路中的重要成員之一，在細胞內(nèi)有多種作用底物，可使底物分子內(nèi)的絲氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而調(diào)整底物的活化狀態(tài)，參與細胞內(nèi)多種生物學(xué)反應(yīng)過程[6]。PKC在心肌細胞內(nèi)有諸多的功能靶位，其中PKC對心肌細胞膜以及肌漿網(wǎng)離子通道等的磷酸化在心肌細胞功能的調(diào)節(jié)中具有十分重要的作用。越來越多的證據(jù)表明心肌細胞L-Ca2+通道是PKC的作用目標之一[7,8]。在體研究表明L-Ca2+通道α1c和β2a亞基是PKC的作用底物[9]。有研究表明心肌中PKC活性的增加可以增加L型鈣電流[4]。我們的實驗結(jié)果顯示花生四烯乙醇胺可以明顯抑制心肌細胞PKC的活性，此效應(yīng)可以被PKC的非特異性激動劑PMA或CB1受體阻斷劑AM251取消；PMA同時可以取消花生四烯乙醇胺對L型鈣電流的抑制效應(yīng)。說明花生四烯乙醇胺激活心肌細胞CB1受體后，抑制胞內(nèi)PKC的活性，從而抑制L型鈣電流。

我們進一步探討花生四烯乙醇胺激活CB1受體后通過何種途徑抑制PKC活性。研究表明CB1受體為 G蛋白耦聯(lián)受體[1]，PKC激活的經(jīng)典途徑為通過G 蛋白介導(dǎo)活化PLCβ以水解PIP2為IP3和DAG，DAG進一步激活PKC[10]。本實驗結(jié)果表明，用花生四烯乙醇胺激活心肌CB1受體后，胞內(nèi)DAG含量和磷酸化PLCβ都沒有明顯變化，說明激活花生四烯乙醇胺抑制PKC活性的過程中沒有PLCβ-DAG途徑參與。

總結(jié)，本實驗首次證明內(nèi)源性大麻素物質(zhì)花生四烯乙醇胺激活心肌細胞CB1受體后抑制細胞PKC的活性，從而抑制L型鈣電流，此過程沒有PLCβ-DAG途徑參與。至于何種途徑參與其中需要更多的實驗加以證明。

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InhibitoryeffectofendocannabinoidanandamideonL-typecalciumcurrentbyregulatingproteinkinaseCactivity

HAOGuimin*,CUINa*,LIXuehui,etal.

*DepartmentofReproduction,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate whether anandamide,one of endocannabinoids,can inhibit L-type calcium current by rebulating protein kinase C (PKC) activity,and to explore the possible signal pathway that may change PKC activity.MethodsL-type calcium current of single cardiomyocyte was recorded by whole cell patch clamp technique;the PKC activity was detected by PepTag non radioactive protein kinase C detection system (Promega);DAG content within cell was determined by ELISA kit;the expressions of PLCβ and p-PLCβ were detected by Western Blot.ResultsAnandamide significantly inhibited L-type calcium current after perfusion of myocytes (P<0.05),and the effect could be blocked by pretreatment of CB1 receptor antagonist AM251 or PKC nonspecific agonist PMA,however,CB2 recepor antagonist AM630 had no the effect.Anandamide could inhibit significantly PKC activity (P<0.05),similarly,pretreatment of AM251 or PMA could block the effect,however,AM630 had no the effect.Anandamide had no effect on DAG content as well as expressions of PLCβ and p-PLCβ.ConclusionThe experimental results demonstrate that endocannabinoid-anandamide can inhibit PKC activity by activating CB1 receptor to inhibit L-type calcium current,however,PLCβ-DAG signal pathway is not involved in the process.

endocannabinoid;endocannabinoid receptor;anandamide;protein kinase C;L-type calcium channel

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.22.001

項目來源：國家自然科學(xué)基金(編號：81370355，31100823)，河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(編號：20110039)

050000 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科(郝桂敏、崔娜)；河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(李學(xué)慧)；河北醫(yī)科大學(xué)生理教研室(李茜)

李茜，050017 河北醫(yī)科大學(xué)生理教研室；

E-mail：liqian963@163.com

Q 463

A

1002-7386(2014)22-3365-05

2014-06-13)