張狀

【摘要】 目的 探討阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。方法 選用健康Sprague-Dawley（SD）大鼠， 隨機分為阿托伐他汀預處理組、單純缺血組和假手術組。阿托伐他汀預處理組于術前15 d灌胃阿托伐他汀， 6 mg/（kg·d）， 然后制備大鼠局灶性腦缺血模型， 缺血后24 h行神經行為學評分、化學比色法測定腦組織勻漿中SOD活性。結果 與假手術組比較， 局灶性腦缺血24 h， 腦組織SOD活性明顯下降（P<0.05）。與單純缺血組比較， 阿托伐他汀預處理組明顯降低神經行為學評分（P<0.05）， 提高腦組織勻漿SOD活性（P<0.05）。結論 阿托伐他汀可以改善局灶性腦缺血大鼠神經行為學評分， 提高腦組織SOD活性， 增強氧自由基清除作用， 具有神經保護作用。

【關鍵詞】 阿托伐他??；局灶性腦缺血；超氧化物歧化酶

缺血性腦損傷是多種因素、多種機制共同參與的級聯(lián)反應過程， 興奮性氨基酸毒性、鈣超載、自由基反應、炎癥和細胞凋亡是導致缺血性腦損傷的重要環(huán)節(jié)[1]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是體內主要的抗氧化酶之一， 它能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應， 清除超氧陰離子自由基， 具有阻斷自由基的毒性作用[2]， 保護細胞免受損傷[2]。腦缺血時體內自由基的產生和清除自由基的動態(tài)平衡狀態(tài)遭到破壞， 使得SOD減少， 清除自由基能力下降， 氧自由基蓄積， 可導致神經元興奮、潰變、死亡， 產生興奮性毒性， 造成廣泛的腦組織病理性損害[3]。本研究從氧自由基的角度來探討阿托伐他汀對缺血性腦損傷的保護作用及機制， 為臨床尋找新的腦保護藥物提供一條途徑。

1 材料與方法

1. 1 材料 選用健康SD 大鼠36只， 雌雄各半， 體重180～240 g（遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供）。許可證號：SCXK（遼）200320007。實驗動物級別：普通級。

1. 2 實驗藥品和試劑 阿托伐他?。狠x瑞制藥有限公司， 規(guī)格20 mg；SOD試劑盒：南京建成生物工程研究所提供。

1. 3 實驗分組 36只大鼠隨機分為假手術組、單純缺血組、阿托伐他汀預處理組， 每組12只大鼠。阿托伐他汀預處理組于術前灌胃阿托伐他汀， 6 mg/（kg·d）， 共15 d， 假手術組和單純缺血組分別予以等量生理鹽水， 療程和給藥方法相同。制備大鼠局灶性腦缺血模型， 每組12只大鼠于缺血后24 h進行取材。

1. 4 SD大鼠局灶性腦缺血模型（MCAO）的制備 大鼠局灶性腦缺血模型[4]（middle cerbral artery occlusion， MCAO）手術前12 h禁食不禁水。選用標準大鼠麻醉劑量， 以10%水合氯醛3 ml/kg， 經腹腔麻醉， 仰臥固定于手術臺上， 頸部正中切開皮膚及淺筋膜， 鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌， 暴露左側頸總動脈（CCA）和迷走神經， 頸外動脈（ECA）， 頸內動脈（ICA）， ICA的顱外分支——翼腭動脈， 在近心端結扎CCA， 在頸總動脈分叉處結扎ECA， 結扎翼腭動脈。將ICA遠心端用動脈夾夾閉， 距頸總動脈分叉處近心端0.5 cm處將頸總動脈剪一小口， 插入備好的碳素魚線， 去除動脈夾， 沿著ICA輕輕向前推進， 注意不要誤入翼腭動脈， 當?shù)竭_指定長度（18 mm左右）時結扎ICA并固定魚線。假手術組動物， 除手術過程中不插入線栓以外， 其他過程相同。以青霉素局部消毒后縫合皮膚。術后保持環(huán)境溫度在25～30℃左右。尤其要注意動物頭部的保溫。模型成功的標志是大鼠即刻出現(xiàn)右側Horner征。

1. 5 神經行為學評分 參考經典的Zea Longa[5]法對大鼠在MCAO術后清醒后到24 h進行3次神經功能評分， 取平均值。見表1。

表1 神經功能缺失評分標準

分數(shù) 表現(xiàn)

0 無神經功能缺損癥狀， 活動正常

1 輕微神經功能缺損， 不能完全伸展對側前爪

2 中度局灶性神經功能缺損， 爬行時出現(xiàn)向對側轉圈（追尾現(xiàn)象）

3 重度局灶性神經功能缺損， 行走時身體向對側傾斜

4 不能自發(fā)行走， 意識水平下降

1. 6 化學比色法測定腦組織勻漿中SOD活力 MCAO術后， 在固定時間點分別將大鼠各以10%水合氯醛經灌胃深度麻醉后置于解剖臺上， 斷頭， 冰盤上經枕骨大孔開顱取出腦組織， 用冷生理鹽水沖洗除去血液， 濾紙拭干， 切取左側大腦頂葉皮質約100 mg， 經電子天平稱重后放入勻漿器中， 按W/V=1/9的比例加入預冷的生理鹽水冰浴下勻漿， 制備10%的腦組織勻漿， 3500 r/min低溫離心， 15 min， 取上清液， 冰箱-20℃保存?zhèn)溆茫?嚴格按SOD試劑盒（黃嘌呤氧化酶法）檢測腦組織勻漿SOD活力。

1. 7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和t檢驗等統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠神經行為學評分的影響 與假手術組相比， 單純缺血組大鼠神經功能缺損癥狀顯著增加（P<0.05）；阿托伐他汀組神經行為學評分顯著低于單純缺血組（P<0.05）。結果見表2。

表2 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠神經行為學

評分的影響（ x-±s， n=6）

組別 假手術 單純缺血 阿托伐他汀預處理

24 h 0 3.42±0.78a 2.85±0.58b

注：與假手術組相比， aP<0.05；與單純缺血組相比， bP<0.05

2. 2 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織勻漿SOD活力的影響 與假手術組相比， 單純缺血組大鼠腦組織勻漿SOD活力降低（P<0.05）；與單純缺血組相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高（P<0.05）。結果見表3。

表3 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠缺血側腦組織

勻漿SOD活力（U/mg prot）的影響（ x-±s， n=6）

組別 假手術 單純缺血 阿托伐他汀預處理

24 h 123.46±4.12 66.21±3.48a 97.84±3.06b

注：與假手術組相比， aP<0.05；與單純缺血組相比， bP<0.05

3 討論

細胞內的鈣超載和氧自由基損傷在缺血性腦損傷發(fā)病機理中占有重要地位[6]。在腦缺血時， 細胞膜去極化， 激活電壓依賴性的鈣通道（VDCCs）， 大量Ca2+內流， 胞漿Ca2+濃度異常升高， 細胞內Ca2+超載通過三個方面引起自由基的大量產生， 即磷脂酶途徑[7]、黃嘌呤氧化酶途徑[8]和一氧化氮合酶途徑[9]， 使血清自由基產物增加[10]。

本研究觀察了阿托伐他汀[6 mg/（kg·d）]對局灶性腦缺血24 h大鼠神經行為學， 腦組織SOD活力的影響。結果顯示：與假手術組比較， 單純缺血組大鼠神經功能缺損癥狀顯著增加 （P<0.05）， 阿托伐他汀預處理組的神經行為學評分低于單純缺血組（P<0.05）， 表明阿托伐他汀可明顯改善腦缺血后神經功能缺損癥狀。缺血24 h大鼠腦組織勻漿SOD活力降低 （P<0.05）；與單純缺血組相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高 （P<0.05）。表明阿托伐他汀能改善神經缺損癥狀， 對腦缺血大鼠具有神經保護作用， 其機制可能與增加大鼠腦組織SOD活力， 減輕腦缺血時氧自由基的毒性有關。

本實驗從阿托伐他汀通過改善局灶性腦缺血大鼠神經行為學評分及降低氧自由基損傷的角度研究阿托伐他汀的神經保護作用， 為臨床應用阿托伐他汀提供了理論依據(jù)。

參考文獻

[1] Zador Z， Benyo Z， Lacza Z， et al. Neuroprotection in brain ischemia-doubts and hopes.Ideggyogy Sz， 2012， 57（3-4）：81-93.

[2] Fagan SC， Hess DC， Machado LS， et al. Tactics for vascular protection after acute ischemic stroke.Pharmacotherapy， 2013， 25（3）：387-395.

[3] Suzuki Y， Takagi Y， Nakamuro B， et al. Ablity of NMDA and non-NMDA receptor antagonists to inhibit cerebral ischemia damage in rats.Bain Bes， 2013， 964（1）：116-120.

[4] 陳佳俊， 石巖殊， 韓雪梅. 線栓法大鼠局灶性腦缺血模型（PMCAO）的實驗研究.吉林醫(yī)學， 2004， 25（10）：16-17.

[5] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke， 1989， 20（1）：84-91.

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[7] Mc-Cord JM， Roy RS， Schaffer SW.Free radicals and myocardial ischemia.The role of xanthine oxidase.Adv Myocardiol， 2011（5）：183-189.

[8] Dawson TM， Dawson VL， Snyder SH.A novel neuronal messenger molecule in brain： the free radical， nitric oxide.Ann Neurol， 2012（32）：297-311.

[9] Brown RH. Amyotrophic lateral sclerosis-A new role for old drugs.N Engl J Med， 2011， 352（13）：1376.

[收稿日期：2014-04-24]

2. 2 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織勻漿SOD活力的影響 與假手術組相比， 單純缺血組大鼠腦組織勻漿SOD活力降低（P<0.05）；與單純缺血組相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高（P<0.05）。結果見表3。

表3 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠缺血側腦組織

勻漿SOD活力（U/mg prot）的影響（ x-±s， n=6）

組別 假手術 單純缺血 阿托伐他汀預處理

24 h 123.46±4.12 66.21±3.48a 97.84±3.06b

注：與假手術組相比， aP<0.05；與單純缺血組相比， bP<0.05

3 討論

細胞內的鈣超載和氧自由基損傷在缺血性腦損傷發(fā)病機理中占有重要地位[6]。在腦缺血時， 細胞膜去極化， 激活電壓依賴性的鈣通道（VDCCs）， 大量Ca2+內流， 胞漿Ca2+濃度異常升高， 細胞內Ca2+超載通過三個方面引起自由基的大量產生， 即磷脂酶途徑[7]、黃嘌呤氧化酶途徑[8]和一氧化氮合酶途徑[9]， 使血清自由基產物增加[10]。

本研究觀察了阿托伐他汀[6 mg/（kg·d）]對局灶性腦缺血24 h大鼠神經行為學， 腦組織SOD活力的影響。結果顯示：與假手術組比較， 單純缺血組大鼠神經功能缺損癥狀顯著增加 （P<0.05）， 阿托伐他汀預處理組的神經行為學評分低于單純缺血組（P<0.05）， 表明阿托伐他汀可明顯改善腦缺血后神經功能缺損癥狀。缺血24 h大鼠腦組織勻漿SOD活力降低 （P<0.05）；與單純缺血組相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高 （P<0.05）。表明阿托伐他汀能改善神經缺損癥狀， 對腦缺血大鼠具有神經保護作用， 其機制可能與增加大鼠腦組織SOD活力， 減輕腦缺血時氧自由基的毒性有關。

本實驗從阿托伐他汀通過改善局灶性腦缺血大鼠神經行為學評分及降低氧自由基損傷的角度研究阿托伐他汀的神經保護作用， 為臨床應用阿托伐他汀提供了理論依據(jù)。

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[收稿日期：2014-04-24]

2. 2 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠腦組織勻漿SOD活力的影響 與假手術組相比， 單純缺血組大鼠腦組織勻漿SOD活力降低（P<0.05）；與單純缺血組相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高（P<0.05）。結果見表3。

表3 阿托伐他汀對局灶性腦缺血大鼠缺血側腦組織

勻漿SOD活力（U/mg prot）的影響（ x-±s， n=6）

組別 假手術 單純缺血 阿托伐他汀預處理

24 h 123.46±4.12 66.21±3.48a 97.84±3.06b

注：與假手術組相比， aP<0.05；與單純缺血組相比， bP<0.05

3 討論

細胞內的鈣超載和氧自由基損傷在缺血性腦損傷發(fā)病機理中占有重要地位[6]。在腦缺血時， 細胞膜去極化， 激活電壓依賴性的鈣通道（VDCCs）， 大量Ca2+內流， 胞漿Ca2+濃度異常升高， 細胞內Ca2+超載通過三個方面引起自由基的大量產生， 即磷脂酶途徑[7]、黃嘌呤氧化酶途徑[8]和一氧化氮合酶途徑[9]， 使血清自由基產物增加[10]。

本研究觀察了阿托伐他汀[6 mg/（kg·d）]對局灶性腦缺血24 h大鼠神經行為學， 腦組織SOD活力的影響。結果顯示：與假手術組比較， 單純缺血組大鼠神經功能缺損癥狀顯著增加 （P<0.05）， 阿托伐他汀預處理組的神經行為學評分低于單純缺血組（P<0.05）， 表明阿托伐他汀可明顯改善腦缺血后神經功能缺損癥狀。缺血24 h大鼠腦組織勻漿SOD活力降低 （P<0.05）；與單純缺血組相比， 阿托伐他汀大鼠腦組織勻漿SOD活力升高 （P<0.05）。表明阿托伐他汀能改善神經缺損癥狀， 對腦缺血大鼠具有神經保護作用， 其機制可能與增加大鼠腦組織SOD活力， 減輕腦缺血時氧自由基的毒性有關。

本實驗從阿托伐他汀通過改善局灶性腦缺血大鼠神經行為學評分及降低氧自由基損傷的角度研究阿托伐他汀的神經保護作用， 為臨床應用阿托伐他汀提供了理論依據(jù)。

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[4] 陳佳俊， 石巖殊， 韓雪梅. 線栓法大鼠局灶性腦缺血模型（PMCAO）的實驗研究.吉林醫(yī)學， 2004， 25（10）：16-17.

[5] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke， 1989， 20（1）：84-91.

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[7] Mc-Cord JM， Roy RS， Schaffer SW.Free radicals and myocardial ischemia.The role of xanthine oxidase.Adv Myocardiol， 2011（5）：183-189.

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[9] Brown RH. Amyotrophic lateral sclerosis-A new role for old drugs.N Engl J Med， 2011， 352（13）：1376.

[收稿日期：2014-04-24]