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(第三軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市納米醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心，重慶 400038)

血小板減少癥常見于放療、化療和骨髓移植患者，嚴(yán)重的血小板降低直接威脅到人們的生命安全[1]。目前，臨床上治療血小板減少癥的主要方法為直接輸注血小板，但因治療費(fèi)用昂貴導(dǎo)致使用受到限制。因此，尋找高效、廉價(jià)的升血小板藥物就顯得非常迫切和重要。我室通過基因重組技術(shù)成功將血小板生成素模擬肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)和人生長(zhǎng)激素(human growth hormone，hGH)進(jìn)行融合，研制出重組融合蛋白dTMP-GH[2-3]。在此基礎(chǔ)上，我室對(duì)該融合蛋白的發(fā)酵和純化制備工藝進(jìn)行了細(xì)致的研究，現(xiàn)已能獲得純度大于98%的重組融合蛋白dTMP-GH。作為一種新型升血小板因子，dTMP-GH具有顯著的刺激巨核細(xì)胞增殖、分化的作用，以達(dá)到促進(jìn)血小板生成的生物學(xué)活性[4]，有望成為治療造血功能障礙引起的血小板減少癥的一種新方式。為了研究dTMP-GH在體內(nèi)的分布情況，本研究制備了125I-dTMP-GH，并對(duì)其在小鼠體內(nèi)的分布進(jìn)行研究，證實(shí)dTMP-GH融合蛋白具有骨髓偏向性分布的特點(diǎn)，為進(jìn)一步探索dTMP-GH促血小板生成作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

融合蛋白dTMP-GH由本室自行制備，Na125I購自中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所，快速薄層層析-硅膠紙(ITL-SG)購自美國Gelman公司，Sepdex 75層析柱購自美國GE公司，Iodogen(1,3，4，6-四氯3,6-二苯-甘脲)購自美國Sigma公司，偶聯(lián)劑DOTA購自美國Macrocyclics公司，TRIS購自美國Angus公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。γ免疫計(jì)數(shù)儀 購自美國Perkin Elmer，電子天平購自沈陽龍騰電子，蛋白純化儀AKTA prifier 10購自美國GE公司，紫外分光光度計(jì)購自BECKMAN公司。Bal b/c小鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 dTMP-GH的制備 取dTMP-GH接種于Amp+LB平板，在37 ℃中培養(yǎng)18 h后挑取單克隆接種于Amp+LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)的dTMP-GH菌液接種到發(fā)酵罐中32 ℃擴(kuò)增培養(yǎng)，5 h后變溫至42 ℃誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)5 h后離心收取菌體。

1.2.2 dTMP-GH的純化 將表達(dá)的dTMP-GH菌體按100 g/L用雙蒸水重懸后進(jìn)行高壓勻漿破菌。破菌后，8 000 r/min離心棄去上清，沉淀用Buffer A(Tirs堿0.02 mol/L,尿素8 mol/L,pH 8.0)溶解。取dTMP-GH的溶解液過SP柱并收集穿透液，用透析法除去穿透液中的尿素。將透析完畢的dTMP-GH上Q柱，分別用濃度為0.05 mol/L、0.15 mol/L、0.5 mol/L和1 mol/L的NaCl進(jìn)行洗脫，收集各洗脫組分電泳。選取電泳中純度最高的dTMP-GH過分子篩Sepdex 75，收取目的蛋白用Bradford法測(cè)定濃度。

1.2.3125I-dTMP-GH的標(biāo)記 利用氯胺-T法對(duì)dTMP-GH進(jìn)行放射性碘標(biāo)記。標(biāo)記管中依次加入50 μl融合蛋白dTMP-GH(1.5 mg/mL),5 μl Na125I(19.6 MBq)，10 μl氯胺-T(3 mg/mL，50 mmol/L PBS，pH 7.5)，震蕩反應(yīng)5 min，加入20 μl Na2S2O3(8 mg/mL，50 mmol/L PBS，pH 7.5)終止反應(yīng)。

1.2.4125I-dTMP-GH的純化 采用Sepdex 75柱除去未結(jié)合的放射性碘。先用含1%BSA的PBS進(jìn)行柱平衡過夜，再用PBS洗20個(gè)柱體積，加入樣品，用PBS洗脫，分管收集，每管0.5 mL，共收集30管，分別取2 μl加入塑料測(cè)量管中用免疫計(jì)數(shù)儀測(cè)量每管放射性計(jì)數(shù)，并測(cè)定每管蛋白含量。將上述測(cè)量管中計(jì)數(shù)率高并且蛋白濃度大于20 μg/mL的混合，用PBS調(diào)整蛋白濃度至20 μg/mL，放置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5125I-dTMP-GH生物學(xué)活性測(cè)定 將MO7e細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)旺盛期時(shí)采取rhGM-CSF饑餓24 h后按2×105/mL濃度轉(zhuǎn)接至96孔U型板中，每孔100 μl。按照10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的藥品終濃度分別加入125I-dTMP-GH和dTMP-GH每個(gè)孔6個(gè)復(fù)孔再培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完畢后每孔加入CCK-8試劑10 μl,再培養(yǎng)6 h后使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)胞光密度值。

1.2.6125I-dTMP-GH在小鼠體內(nèi)分布 將5～7周齡20 g左右的Bal b/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組9只，腹腔注射0.1 mL 1 mg/mL的KI，其目的是抑制125I 與甲狀腺的結(jié)合。30 min后按100 μg/kg的125I-dTMP-GH經(jīng)小鼠尾靜脈注射給藥。給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h斷頸處死小鼠，分別取心、肝、脾、腎、股骨、甲狀腺等器官，稱重，測(cè)量各樣品放射性計(jì)數(shù)。另取2 μg的125I-dTMP-GH作為注射總計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白dTMP-GH的純化

收集流穿SP柱的dTMP-GH包涵體溶液，透析完畢再過Q柱，經(jīng)分子篩Sepdex 75純化后可得純度大于98%的dTMP-GH(圖1)。

圖1 dTMP-GH的12%SDS-PAGE電泳圖

2.2 125I-dTMP-GH的標(biāo)記效果

125I-dTMP-GH標(biāo)記物經(jīng)Sepdex 75柱純化后(圖2)，標(biāo)記率為71.53%，放化純度為96.53%，比活度為0.22 MBq/μl。

圖2 125I-dTMP-GH經(jīng)Sepdex 75柱純化

2.3 125I-dTMP-GH對(duì)MO7e細(xì)胞體外增殖活性

將dTMP-GH和125I-dTMP-GH同時(shí)通過CCK-8法檢測(cè)對(duì)MO7e細(xì)胞體外增殖活性作用(圖3)。125I-dTMP-GH和dTMP-GH在10 ng/mL至100 ng/mL都呈現(xiàn)出隨用藥量的增加增殖效果越好，在100 ng/mL至200 ng/mL隨用藥量的增加增殖效果無明顯變化。以100 ng/mL點(diǎn)為對(duì)比標(biāo)記后比活性為標(biāo)記前的93%，表明標(biāo)記對(duì)dTMP-GH活性的影響不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3不同濃度dTMP-GH與125I-dTMP-GH對(duì)MO7e細(xì)胞增殖效果的對(duì)比

2.4 125I-dTMP-GH在小鼠體內(nèi)分布

尾靜脈注射125I標(biāo)記的dTMP-GH后，分別于各時(shí)間點(diǎn)取材、稱重、檢測(cè)放射性計(jì)數(shù)，并計(jì)算出每克組織含放射性計(jì)數(shù)量。如圖4所示：小鼠注射125I-dTMP-GH后被迅速吸收和代謝，在30 min時(shí)股骨中放射性計(jì)數(shù)達(dá)到最高，之后隨機(jī)體代謝含量逐漸降低,同時(shí)也提示腎臟是dTMP-GH主要代謝器官。

圖4 125I-dTMP-GH在各組織不同時(shí)間分布

3 討論

血小板生成素(thrombopoietin TPO)，也稱為巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育因子(megakaryocyte growth and development factor,MGDF)，是影響巨核細(xì)胞增殖、分化和血小板生成的重要細(xì)胞因子[5]，可與巨核細(xì)胞的受體c-Mpl特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞的分化和血小板的生成[6-9]。Cwirla等人[10]通過噬菌體表面展示技術(shù)篩選得到與天然TPO具有相似生物學(xué)活性的蛋白多肽TMP。TMP由14個(gè)氨基酸組成與天然TPO無同源序列，但可以與TPO受體(c-Mpl)高親和力結(jié)合。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過化學(xué)合成的TMP能夠刺激依賴細(xì)胞株(Ba/F3/c-Mpl)的增殖分化，與rhTPO有相似生物學(xué)效性[9-12]。但由于TMP只有14個(gè)氨基酸組成，自身分子量太小，用基因工程方法制備難度較大，而進(jìn)行大量的化學(xué)合成成本非常高。并且TMP是一條線性多肽，在體內(nèi)循環(huán)過程中極易被降解、半衰期過短，所以TMP單體很難直接成藥。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中通過基因重組技術(shù)將TMP分子與人生長(zhǎng)激素進(jìn)行融合，不僅可以增大分子量，使其能夠進(jìn)行基因工程制備，并使其體內(nèi)半衰期得到延長(zhǎng)?，F(xiàn)已實(shí)現(xiàn)，融合蛋白dTMP-GH在成本低廉的大腸桿菌系統(tǒng)中高效表達(dá)，并已能獲得純度大于98%的dTMP-GH融合蛋白。本課題前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)dTMP-GH能夠促進(jìn)小鼠血小板升高，并對(duì)巨核細(xì)胞增殖作用明顯[4]。

本文通過用放射性125I標(biāo)記dTMP-GH的方法，進(jìn)一步研究融合蛋白dTMP-GH在小鼠體內(nèi)主要臟器動(dòng)態(tài)分布情況。結(jié)果表明：被放射性碘標(biāo)記的dTMP-GH經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)后，dTMP-GH經(jīng)血液循環(huán)立即向骨髓聚集，在30 min時(shí)達(dá)到最高值(僅股骨的放射性計(jì)數(shù)就占到注射總量的10%)，并隨著時(shí)間推移逐漸降低。促使dTMP-GH具有骨髓偏向分布特性原因可能來自兩個(gè)方面：一個(gè)方面來自dTMP-GH中的TMP，TMP是TPO的模擬物，要發(fā)揮其自身促血小板生成的生物學(xué)活性就必須要結(jié)合巨核系祖細(xì)胞表面的TPO受體c-Mpl。巨核系祖細(xì)胞是通過造血干細(xì)胞分化而來，而機(jī)體中富含造血干細(xì)胞最多的地方就是骨髓腔。另一個(gè)方面來自dTMP-GH中的GH，GH在臨床主要用于燒傷患者和矮小癥患者，它其中一個(gè)重要的生理功能就是能夠促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)；GH進(jìn)入血液后可以高親和結(jié)合人生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白(growth hormone binding proteins，GHBP)[13-15]，并通過GHBP將其運(yùn)送至骨髓發(fā)揮生理功能。還有文獻(xiàn)報(bào)道指出，rhGH對(duì)多系造血祖細(xì)胞的存活和增殖有直接作用[16]，并能夠促進(jìn)輻射損傷小鼠骨髓造血功能重建[17]，這說明GH與TPO有著相似或相關(guān)的信號(hào)通路?？赡苁荊H通過與其受體(growth hormone receptor,GHR)的結(jié)合激活了這一生物學(xué)活性；該受體與c-Mpl為同一類細(xì)胞因子，都是巨核細(xì)胞表面受體，所以能夠激活相似的信號(hào)通路。

血小板的體內(nèi)生成過程主要有：造血干細(xì)胞→髓系造血祖細(xì)胞→巨核系祖細(xì)胞→前巨核細(xì)胞→成熟巨核細(xì)胞→血小板；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，融合蛋白dTMP-GH可以促進(jìn)巨核細(xì)胞生成血小板[4]。產(chǎn)生這一生物學(xué)效應(yīng)的原因可能是：融合蛋白dTMP-GH進(jìn)入機(jī)體后，通過與GHBP的結(jié)合將其運(yùn)送至骨髓；在骨髓中TMP與c-Mpl結(jié)合，GH與GHR結(jié)合，而c-Mpl和GHR都是巨核細(xì)胞表面受體，二者共同刺激巨核細(xì)胞增殖、分化、產(chǎn)生血小板。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明融合蛋白dTMP-GH具有顯著的骨髓偏向分布特性，該特性可以提高dTMP-GH促巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成的生物利用度，降低使用用量和產(chǎn)生毒副反應(yīng)危險(xiǎn)，從一個(gè)側(cè)面證實(shí)了前面提到的融合蛋白dTMP-GH促巨核細(xì)胞增值、產(chǎn)生血小板這一生物學(xué)效應(yīng)的推測(cè)，并為今后深入研究dTMP-GH促血小板生成的分子作用機(jī)制提供了思路。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到在腎臟中放射性計(jì)數(shù)也比較高，肝臟的放射性計(jì)數(shù)第三，說明dTMP-GH在體內(nèi)主要通過肝臟進(jìn)行代謝，再由腎臟排出到體外或者部分直接由腎臟排出。通過本實(shí)驗(yàn)可以看出，骨髓是dTMP-GH在體內(nèi)的重要靶器官之一，在體內(nèi)時(shí)dTMP-GH通過肝臟進(jìn)行主要的代謝，并且腎臟是其重要排泄器官。本實(shí)驗(yàn)為我們今后進(jìn)一步研究重組融合蛋白dTMP-GH的分子作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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