，， ，，

(第三軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市納米醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心，重慶 400038)

微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類(lèi)由基因組編碼的長(zhǎng)度約20 nt的高度保守的內(nèi)源性微小的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)與對(duì)應(yīng)的靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’ untranslated region,3’UTR)的非完全或完全配對(duì)結(jié)合，從而阻止其翻譯或破壞其穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[1]。越來(lái)越多的研究表明，miRNAs 參與了細(xì)胞增殖、凋亡、分化等眾多基礎(chǔ)生物學(xué)事件，是一類(lèi)重要的調(diào)控分子，其在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用也越來(lái)越受到重視[2-3]。我們和其他學(xué)者均發(fā)現(xiàn)，miR-21在皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，創(chuàng)面局部抑制其表達(dá)能夠顯著削弱愈合的速度與質(zhì)量，證實(shí)其是創(chuàng)傷促愈的重要分子，也提示其可能是促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的新的治療靶點(diǎn)[4-5]。為進(jìn)一步研究miR-21作為潛在治療靶點(diǎn)的可行性，本研究構(gòu)建了miR-21真核表達(dá)質(zhì)粒，為后續(xù)使用其進(jìn)行創(chuàng)面局部干預(yù)治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pRc/CMV、pMIR-Reporter、β-半乳糖苷酶質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α和293細(xì)胞由本所保存。快速質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、β半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒和熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司，基因組DNA提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、總RNA提取試劑RNAiso購(gòu)自TaKaRa公司，引物和探針由上海英駿公司合成，Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。尼龍膜為Roche公司產(chǎn)品，雜交液購(gòu)自Clontech。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的含有miR-21前體序列(pre-miR-21)的小鼠基因組序列，針對(duì)pre-miR-21上游154 bp和下游136 bp之間的382 bp的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，并在引物上引入末端的保護(hù)性堿基、Hind Ⅲ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)(下劃線序列)。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下：F:5’-CCCAAGCTTCCCTGTTCATTTTGTTTTGC-3’；R:5’-TGCTCTAGA CTTGATACTGCTGCTGTTGT-3’。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 取C57小鼠1只，剪取尾部組織，依照試劑盒說(shuō)明提取全基因組DNA。以小鼠基因組DNA為模板，行PCR擴(kuò)增，得到約390 bp的目的片段，退火溫度為50 ℃。

1.2.3 真核表達(dá)載體pRC/CMV-mmu-miR-21構(gòu)建與鑒定 以Hind Ⅲ和XbaⅠ對(duì)質(zhì)粒pRC/CMV行雙酶切，酶切后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。同時(shí)對(duì)PCR擴(kuò)增的mmu-miR-21基因的產(chǎn)物以PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化后也以Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切，酶切后重復(fù)進(jìn)行產(chǎn)物純化。將酶切純化后的pRC/CMV和mmu-miR-21PCR片段以T4DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，LB平板篩選氨芐青霉素抗性克隆，菌落PCR初步鑒定陽(yáng)性克隆，Hind Ⅲ/XbaⅠ雙酶切鑒定后送測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)。

1.2.4 pmiR-21-Luc reporter熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建 合成含有與miR-21分子完全互補(bǔ)的寡核苷酸序列，F(xiàn):5’-CAATGCACTAGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTAgctcagcAATGCA-3’；R:5’-AGCTTGCATTgctgagcTAGCTTATCAGACTGATGTTGAACTAGTGCATTGAGCT-3’。正向序列下劃線為其與成熟的miR-206分子完全互補(bǔ)的DNA序列；小寫(xiě)字母序列為引入的Blp I酶切位點(diǎn)序列，以便于連接成功后的鑒定；反向序列與正向除完全互補(bǔ)外，在兩端引入了Sac I和Hind Ⅲ突出的酶切位點(diǎn)序列，以斜體大寫(xiě)字母表示。以Sac I和Hind Ⅲ對(duì)pMIR-Reporter質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切而后純化回收與寡核苷酸退火產(chǎn)物以T4DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌，LB平板篩選氨芐青霉素抗性克隆，Hind Ⅲ/XbaⅠ雙酶切鑒定后送測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定克隆的篩選 人胚腎293細(xì)胞，在含10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h以胰酶消化293細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以每孔1×105的數(shù)目接種于24孔板內(nèi)。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2 000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分別轉(zhuǎn)染pRC/CMV空載體和 pRC/CMV-mmu-miR-21等2個(gè)組別。轉(zhuǎn)染后6 h，更換其完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h，換以含G418(1 000 ug/mL)的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，3周后獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染293細(xì)胞miR-21的Northern blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后獲得的穩(wěn)定細(xì)胞系用RNAiso裂解，提取總RNA具體方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA探針序列miR-21：5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’，采用地高辛在3’末端標(biāo)記探針。取20 μg總RNA上樣，行20%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，半干轉(zhuǎn)印恒流0.4 A轉(zhuǎn)尼龍膜1 h。紫外交聯(lián)1 200 μJ/min,而后80 ℃烘烤1 h，加入探針后于42 ℃雜交過(guò)夜。洗膜后以含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的地高辛抗體1︰1 000在37 ℃孵育2 h，NBT/BCIP系統(tǒng)進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增含有pre-miR-21的基因組片段

以小鼠基因組DNA為模板進(jìn)行miR-21前體對(duì)應(yīng)的基因組片段擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，在390 bp處有一清晰特異擴(kuò)增條帶，片段大小與預(yù)測(cè)長(zhǎng)度相符(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒pRC/CMV-mmu-miR-21構(gòu)建

Hind Ⅲ/XbaⅠ雙酶切pRC/CMV-mmu-miR-21重組載體，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)大小約為0.4 kb和5.5 kb片段。其中0.4 kb片段為含有miR-21的前體片段，5.5 kb片段為pRC/CMV載體，經(jīng)測(cè)序證實(shí)插入片段與預(yù)測(cè)結(jié)果完全相符(圖2)。

2.3 重組pmiR-21-Luc reporter熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建

回收Sac I/Hind Ⅲ雙酶pMIR-Reporter質(zhì)粒的產(chǎn)物與前述寡核苷酸的退火產(chǎn)物進(jìn)行連接后電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌，涂氨芐青霉素抗性LB平板后培養(yǎng)挑取克隆搖菌。對(duì)所得的克隆行Blp I單酶切可見(jiàn)陽(yáng)性克隆能夠被成功線性化，出現(xiàn)大小約6 500 bp的條帶(圖3)。進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)插入片段與預(yù)期設(shè)計(jì)完全相符。

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pRC/CMV-mmu-miR-21的293細(xì)胞miR-21表達(dá)的Northern blot鑒定

對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pRC/CMV空載體和pRC/CMV-mmu-miR-21重組質(zhì)粒的293細(xì)胞提取總RNA，行Northern blot檢測(cè)miR-21。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pRC/CMV空載體的293細(xì)胞沒(méi)有雜交信號(hào)，而轉(zhuǎn)染pRC/CMV-mmu-miR-21重組質(zhì)粒的293細(xì)胞中可見(jiàn)明顯而特異的雜交條帶(圖4)。

2.5 pRC/CMV-mmu-miR-21介導(dǎo)的miR-21過(guò)表達(dá)能夠調(diào)控報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性

在熒光素酶基因的3’UTR插入與miR-21完全互補(bǔ)的序列成功構(gòu)建pmiR-21-Luc reporter報(bào)告基因質(zhì)粒后，通過(guò)與miR-21真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)而檢測(cè)熒光素酶活性變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的miR-21可以通過(guò)識(shí)別這一位點(diǎn)進(jìn)而對(duì)熒光素酶的活性起到抑制作用，降低為空質(zhì)粒對(duì)照組的29.19%(P=0.000 12)，差異顯著，表明miR-21真核表達(dá)質(zhì)粒在293細(xì)胞中的產(chǎn)物具有生物活性(圖5)。

M：DL2000 marker；1、2：miR-21前體片段PCR產(chǎn)物

M1：DL2000；M2：DL15000；1-4：Hind Ⅲ/XbaⅠ雙酶切陽(yáng)性克隆

圖2重組質(zhì)粒pRC/CMV-mmu-miR-21的雙酶切鑒定

M：DL15000；1-4：BlpI單酶切質(zhì)粒； 1、3：未重組質(zhì)粒；2、4：重組質(zhì)粒

圖3重組質(zhì)粒pmiR-21-Lucreporter的酶切鑒定

1：空載體對(duì)照；2：pRC/CMV-mmu-miR-21轉(zhuǎn)染組

圖4穩(wěn)定表達(dá)pRC/CMV-mmu-miR-21的293細(xì)胞中miR-21表達(dá)的Northernblot鑒定

*：與空質(zhì)粒對(duì)照組(pRC/CMV)比較，P<0.01

圖5pRC/CMV-mmu-miR-21下調(diào)熒光素酶報(bào)告基因的活性

3 討論

miR-21是進(jìn)化非常保守的一個(gè)miRNA分子，在小鼠定位于11號(hào)染色體，位于穿膜蛋白基因TMEM49的3’UTR區(qū)域。眾多研究表明，miR-21具有促進(jìn)細(xì)胞增殖與遷移、抑制細(xì)胞凋亡等重要功能，由于其在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤組織高表達(dá)，因此認(rèn)為其是一重要的癌基因[6-8]。目前已鑒定出的miR-21分子的靶基因包括PTEN、PDCD4、TPM1等，這些靶基因多屬于抑癌基因，能夠抑制細(xì)胞增殖、移行，促進(jìn)凋亡[9-11]。

我們前期進(jìn)行了小鼠正常皮膚和全層皮膚切割傷修復(fù)早期組織的miRNAs表達(dá)譜差異分析，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證miR-21分子在損傷后上調(diào)非常明顯，原位雜交顯示其在損傷修復(fù)細(xì)胞呈廣譜的上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其作為癌基因在損傷后上調(diào)表達(dá)可能具有重要的促進(jìn)愈合的生理功能。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面局部抑制miR-21分子的表達(dá)能夠顯著抑制創(chuàng)面的愈合，會(huì)明顯延遲創(chuàng)面早期收縮、再上皮化和膠原的后期沉積，表明其是創(chuàng)面愈合的重要促愈分子[5]。其他的研究也相互印證地表明miR-21在創(chuàng)傷愈合中的重要作用[4,12]。然而，亦有學(xué)者認(rèn)為， miR-21在靜脈曲張難愈性創(chuàng)面表達(dá)上調(diào)，參與了創(chuàng)面難愈的發(fā)生[13]。這種截然相反的結(jié)論是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的差別所致，還是實(shí)驗(yàn)材料的不同所致，很有理清的必要。我們認(rèn)為其在損傷后的廣譜表達(dá)上調(diào)，抑制后的修復(fù)延遲，都提示miR-21具有作為促愈靶點(diǎn)的潛力。而創(chuàng)面直接注射裸質(zhì)粒是一種有效的實(shí)驗(yàn)性促愈效應(yīng)觀察手段，為此我們構(gòu)建了miR-21的真核表達(dá)載體。

作為內(nèi)源性分子的miRNAs通常是通過(guò)pol-Ⅱ啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而經(jīng)過(guò)復(fù)雜的剪切加工才形成成熟的單鏈功能分子[14-15]。但利用人工的shRNA的質(zhì)粒骨架，引入類(lèi)似于siRNA的較短設(shè)計(jì)序列也可以實(shí)現(xiàn)miRNA產(chǎn)物的高效加工表達(dá)[16]。然而，作為內(nèi)源性調(diào)控分子的miRNAs的加工有其特殊性，這一點(diǎn)在miR-21分子的表現(xiàn)很明顯，miR-21分子的表達(dá)除了受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，還存在TGF-/Smad通路的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[17]?？紤]到后續(xù)創(chuàng)面研究的實(shí)際情況，存在創(chuàng)面大量TGF-β分子的表達(dá)[18-20]。因此本研究選擇了帶有CMV啟動(dòng)子的pRc/CMV質(zhì)粒。我們將含有pre-miR-21片段的大約400 bp的PCR產(chǎn)物克隆到該真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。然而，其能否成功表達(dá)成熟的miR-21產(chǎn)物還需要驗(yàn)證，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄出的序列的正確加工有賴于其與周?chē)蛄邢嗷プ饔玫慕Y(jié)構(gòu)，克隆產(chǎn)物未必一定能加工出成熟miR-21的分子。為此我們進(jìn)行了后續(xù)的鑒定工作，將重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)基中G418的篩選壓力獲得持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)Northern blot檢測(cè)到其確實(shí)高效表達(dá)了成熟的miR-21分子。miRNA的作用方式主要是與靶mRNA分子的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解或抑制它的翻譯。我們進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因活性分析，確認(rèn)該質(zhì)粒表達(dá)的miR-21可以抑制報(bào)告基因的活性，表明其具有功能。這些工作為后續(xù)在皮膚創(chuàng)面研究miR-21的功能和以其為靶點(diǎn)的促愈策略初步奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms:growth,death,fat,stress,and timing[J].Cell,2003,113(6):673-676.

[2] Roy S,Sen CK.miRNA in wound inflammation and angiogenesis[J].Microcirculation,2012,19 (3):224-232.

[3] Bostjancic E,Glavac D.Importance of microRNAs in skin morphogenesis and diseases[J].Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat,2008,17(3):95-102.

[4] Yang X,Wang J,Guo SL,et al.miR-21 promotes keratinocyte migration and re-epithelialization during wound healing[J].Int J Biol Sci,2011,7(5):685-690.

[5] Wang T,Feng Y,Sun H,et al.miR-21 regulates skin wound healing by targeting multiple aspects of the healing process[J].Am J Pathol,2012,181(6):1911-1920.

[6] Nair VS,Maeda LS,Ioannidis JP.Clinical outcome prediction by microRNAs in human cancer:a systematic review[J].J Natl Cancer Inst,2012,104(7):528-540.

[7] Moore LM,Zhang W.Targeting miR-21 in glioma:a small RNA with big potential[J].Expert Opin Ther Targets,2010,14(11):1247-1257.

[8] Xiong B,Cheng Y,Ma L,et al.MiR-21 regulates biological behavior through the PTEN/PI-3 K/Akt signaling pathway in human colorectal cancer cells[J].Int J Oncol,2013,42(1):219-228.

[9] Qi L,Bart J,Tan LP,et al.Expression of miR-21 and its targets (PTEN,PDCD4,TM1) in flat epithelial atypia of the breast in relation to ductal carcinoma in situ and invasive carcinoma[J].BMC Cancer,2009,9:163.

[10] Wang T,Zhang L,Shi C,et al.TGF-beta-induced miR-21 negatively regulates the antiproliferative activity but has no effect on EMT of TGF-beta in HaCaT cells[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(2):366-376.

[11] Das A,Ganesh K,Khanna S,et al.Engulfment of apoptotic cells by macrophages:a role of microRNA-21 in the resolution of wound inflammation[J].J Immunol,2014,192(3):1120-1129.

[12] Madhyastha R,Madhyastha H,Nakajima Y,et al.MicroRNA signature in diabetic wound healing:promotive role of miR-21 in fibroblast migration[J].Int Wound J,2012,9(4):355-361.

[13] Pastar I,Khan AA,Stojadinovic O,et al.Induction of specific microRNAs inhibits cutaneous wound healing[J].J Biol Chem,2012,287(35):29324-29335.

[14] Cullen BR.Transcription and processing of human microRNA precursors[J].Mol Cell,2004,16(6):861-865.

[15] Zeng Y,Cullen BR.Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells [J].RNA,2003,9(1):112-123.

[16] Wu J,Bonsra AN,Du G.pSM155 and pSM30 vectors for miRNA and shRNA expression[J].Methods Mol Biol,2009,487(2):205-219.

[17] Davis BN,Hilyard AC,Lagna G,et al.SMAD proteins control DROSHA-mediated microRNA maturation[J].Nature,2008,454(7200):56-61.

[18] Werner S,Grose R.Regulation of wound healing by growth factors and cytokines[J].Physiol Rev,2003,83(3):835-870.

[19] Cross KJ,Mustoe TA.Growth factors in wound healing[J].Surg Clin North Am,2003,83(3):531-545.

[20] Grazul-Bilska AT,Johnson ML,Bilski JJ,et al.Wound healing:the role of growth factors[J].Drugs Today (Barc),2003,39(10):787-800.