張陽陽，戴立勝，周 乾，岳 媛，朱亞南，王 帥，徐芳芳，付 瑤，張嘉保

(吉林大學 動物科學學院，吉林 長春 130062；吉林大學 實驗動物中心，長春 130062)

Micro RNA(miRNA)是一類具有組織特異性或發(fā)育階段特異性表達特征的非編碼調(diào)控小RNA，大小為18～24 nt，具有非常重要的生物學意義。miRNA主要通過基因切割和翻譯抑制的方式調(diào)節(jié)mRNA的翻譯或穩(wěn)定性，調(diào)控前體細胞系的增殖和器官的發(fā)生，miRNA通過與靶基因mRNA的種子區(qū)相結合，在生物的生長發(fā)育、組織分化及疾病發(fā)生等過程中起重要的作用，這使得miRNA逐漸成為新的研究熱點[1～5]。

miR-378在各臟器組織中均有表達，作用廣泛，主要與細胞凋亡和血管發(fā)生有關。已有研究表明，小鼠miR-378促進小鼠成肌細胞增長[6]，并通過靶向調(diào)控GalNT7增強腎連蛋白糖基化從而促進小鼠成骨細胞分化[7]。人miR-378靶向調(diào)控Sufu 和Fus-1促進細胞存活、腫瘤生長及血管發(fā)生[8]。miR-378作用廣泛，與多種基因存在靶向作用。因此，本研究分析miR-378在牛各組織器官中的表達情況，檢測其靶作用基因，探究其作用機理，充實牛繁殖育種機理理論基礎，為提高牛各項生產(chǎn)性狀提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在當?shù)剡x定實驗用西門塔爾牛，待被選個體被屠宰時，迅速取出睪丸、垂體、肺臟、肝臟、腎臟、大腦、腸系膜脂肪、小腸、脾臟組織于液氮中臨時保存，隨后保存于-80 ℃冰箱中備用。大腸桿菌感受態(tài)DH5α由實驗室制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取及反轉錄

從-80 ℃冰箱取出各組織樣品，分別取50 mg，根據(jù)Trizol一步法提取總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖電泳鑒定其質(zhì)量，并用Nanodrop測量其濃度。根據(jù)RT-PCR試劑盒(toyobo)內(nèi)說明書進行反轉錄，根據(jù)頸環(huán)反轉錄引物5′GTCGTAATCCAGTGCGTGT CGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACG CCTTCT3′制備miR-378 cDNA第一鏈，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 實時熒光定量 PCR分析

針對 miR-378特異性序列，設計上下游引物(上游引物：5′GGGACTGGACTTGG AGTCA3′下游引物：5′GTGCGTGTCGTGGAG TCG3′)，進行實時熒光定量 PCR。采用U6為內(nèi)標基因，內(nèi)標基因與目的基因各設3個平行反應管。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)試劑盒，反應條件采用三步法，95 ℃預變性 15 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)。相對表達量數(shù)值通過2-ΔΔCt進行計算。

1.2.3 靶基因重組雙熒光素酶報告載體構建

根據(jù)TargetScan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)及RNA22網(wǎng)站(http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)等預測出miR-378候選靶基因。根據(jù)NCBI上候選靶基因SLC26A9成熟序列，選取其3′UTR上包含與miR-378結合位點序列，根據(jù)XhoⅠ和NotⅠ限制性酶切位點設計引物。退火合成靶序列克隆至雙熒光素酶報告載體中。候選靶基因重組質(zhì)粒的突變，在與種子區(qū)結合位點設計4個堿基突變，引物設計見表1。

表1 候選靶基因種子區(qū)擴增引物

1.2.4 雙熒光素酶報告分析

用DMEM高糖基礎培養(yǎng)基(Hyclone)加入10%胎牛血清，1%雙抗于96孔板中培養(yǎng)NIH3T3細胞，將5pmol miR-378 或miR-NC mimics(吉瑪公司)與2 ng靶基因雙熒光素酶報告重組質(zhì)?；蚩蛰d體，用LipofectamineTM 2000共同轉染入NIH3T3細胞中。48 h后每孔用20 μL裂解液(PLB)，15 min搖床充分裂解后，加入Luciferase Assay Substrate及Stop&Glo? Substrate，化學發(fā)光儀設定檢測程序進行檢測。

2 結果與分析

2.1 牛各組織樣品總RNA提取

觀察瓊脂糖凝膠電泳中睪丸、垂體、肺臟、肝臟、腎臟、大腦、小腸、脾臟組織總RNA(圖1)，28 S、18 S、5 S三條帶清晰無雜帶，并測得總RNA濃度均在300 ng/μL～500 ng/μL之間，且A260/280均在1.8～2.0之間，總RNA質(zhì)量良好，可以進行后續(xù)實驗。

圖1 牛各組織RNA瓊脂糖凝膠電泳成像圖

2.2 牛各組織樣品實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR獲得的數(shù)據(jù)用Realplex軟件進行分析。如圖2所示，miR-378在牛大腦、小腸、脾臟表達量相對較高，分別約為肝臟的4倍、4.5倍及8倍。而在睪丸、垂體中表達量相對較少，僅分別約為肝臟的0.1倍及0.2倍。由此可推測，miR-378對牛脂肪、小腸、脾臟的功能具有一定調(diào)節(jié)作用。

2.3 miR-378靶基因生物信息學分析

通過TargetScan、RNA22網(wǎng)站預測出多個靶基因，其功能作用各不相同，詳見表2。

圖2 牛各組織miR-378相對表達水平

表2 miR-378靶基因生物信息學分析

2.2 miR-378靶基因雙熒光素酶報告分析

在預測miR-378候選靶基因的過程中，驗證出SLC26A9基因，其3′UTR種子區(qū)上有與miR-378互補結合的成熟序列AGTCCAG。為了驗證其是否為miR-378的靶基因，我們克隆了psi-CHECK-DDAH1重組質(zhì)粒。已有發(fā)現(xiàn)miR-378靶基因MAPK1，在此作為陽性對照[9]。把SLC26A9重組質(zhì)粒、空白質(zhì)粒、陽性對照質(zhì)粒分別與miR-378或miR-NC mimics 共同轉染入NIH3T3細胞系中，48 h后進行雙熒光素酶報告分析(見圖3)，可見miR-378下調(diào)SLC26A9的海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶的表達比例差異極顯著(P<0.01)。與陽性對照對比，可以驗證SLC26A9為miR-378靶基因。

圖3 靶基因體外雙熒光素酶報告(p<0.01)

3 討論

本研究主要通過實時熒光定量PCR檢測miR-378在牛各內(nèi)臟中的組織相對表達水平，并利用雙熒光素酶報告驗證牛miR-378靶基因SLC26A9，進一步探究牛miR-378的作用機制。

miRNA通過對基因轉錄后調(diào)控而介導了一個全新層次上的基因表達調(diào)控方式。已有研究證實，miRNA參與血管發(fā)生、細胞增殖及細胞凋亡等生命過程中的一系列重要進程，且與動物生長、繁殖、腫瘤疾病等密切相關，可見其在動物生長發(fā)育過程中的重要性。已有報道，miR-378與細胞生長、細胞分化、腫瘤細胞存活、血管發(fā)生等密切相關[6～8]，對動物生長發(fā)育意義重大，但在牛上研究較其他物種相對較少。本研究分析了miR-378在牛各組織相對表達水平及靶作用基因，為其在牛上發(fā)揮作用機制提供理論依據(jù)。

在miR-378靶基因預測過程中分析出候選靶基因，其中SULF1、SOX7、IGF1同對腫瘤細胞發(fā)揮作用，SULF1通過抑制heparin-binding生長因子信號抑制食管鱗狀癌細胞和肝癌細胞的增殖與入侵[10，11]。SOX7抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，抑制肺癌細胞和子宮內(nèi)膜癌細胞[12，13]。IGF1與細胞生長及增殖有關，通過miR-486靶向調(diào)控，抑制肺癌細胞[14，15]。一種miRNA可調(diào)控多個靶基因，一個基因也同時可以被多個miRNA調(diào)控，如果把miR-378與SULF1、SOX7、IGF1聯(lián)系來，共同分析作用機理，可進一步研究對腫瘤發(fā)生與抑制的作用機理，并深化了對miR-378對各組織癌細胞作用機制的研究。

本實驗分析了miR-378在牛各組織分布及其靶基因檢測，為探究牛miR-378功能作用機制提供一定理論依據(jù)，具體miR-378在牛各組織功能作用機制需進一步探究。

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