陸明海，姚玉昌，劉玉峰，王素梅，何海娟，李 武

(1.黑龍江農(nóng)墾科技職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150431；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086；4.黑龍江職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150080)

隨著動(dòng)物基因工程、細(xì)胞工程、胚胎工程等高新生物技術(shù)日新月異的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的制備、哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆、基因打靶、基因敲除等高新生物技術(shù)已開始從實(shí)驗(yàn)室走向廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)[1]。盡管上述高新生物技術(shù)的應(yīng)用前景十分誘人，但是其主要應(yīng)用基礎(chǔ)技術(shù)之一的超數(shù)排卵技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用效果，仍遠(yuǎn)未達(dá)到人們的預(yù)期。影響超數(shù)排卵效果的因素非常復(fù)雜，迄今其獲卵效果還不是十分穩(wěn)定。

筆者在最近兩年進(jìn)行的四次轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，都是利用原核注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊，這種方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是比較有效的的技術(shù)手段，但在這個(gè)過程中需要大量的原核胚胎，而超數(shù)排卵技術(shù)是供應(yīng)大量成熟優(yōu)良的原核胚的重要技術(shù)手段。本文以這四次生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊?yàn)槠鯔C(jī)，對(duì)可能影響轉(zhuǎn)基因山羊超數(shù)排卵的左右卵巢、體重、FSH劑量、超排季節(jié)等因素進(jìn)行系統(tǒng)觀察、統(tǒng)計(jì)和分析，以期提高山羊超數(shù)排卵生產(chǎn)原核胚的生產(chǎn)效率，從而提高轉(zhuǎn)基因山羊的生產(chǎn)效率，為今后生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因山羊奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及設(shè)備

促卵泡素(FSH)100 IU/只，促黃體素(LH)200 IU/只，孕馬血清促性腺激素(PMSG)1 000 IU/只，寧波激素廠產(chǎn)；氯前列烯醇2 mL/只，上海計(jì)劃生育所產(chǎn)；分叉陰道栓(CIDR)20個(gè)/包，沖胚液(PBS)1 000 mL/袋，Holding試劑50 mL/袋，新西蘭產(chǎn)；海綿栓(50個(gè)/包)，黑龍江省農(nóng)科院畜牧所產(chǎn)。

其它實(shí)驗(yàn)藥品有酒精、碘酒、新潔爾滅、抗生素、生理鹽水、青霉素、鏈霉素。

實(shí)驗(yàn)用設(shè)備及器械主要有：腹腔鏡、腹腔內(nèi)輸精槍、沖卵管、細(xì)菌濾器、撿胚針、移胚針、實(shí)體顯微鏡、恒溫臺(tái)、水浴鍋等。

1.2 胚胎的獲取

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物選擇

選擇膘情好，無(wú)明顯繁殖疾病，具有正常發(fā)情周期的山羊作為供體，當(dāng)?shù)赝练N山羊母羊作為受體。

1.2.2 供體山羊超排處理

分別在2010年的5月、7月、12月、2011年12月進(jìn)行了4次超數(shù)排卵轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。每次實(shí)驗(yàn)，分別以受供體同時(shí)埋栓當(dāng)天記第0天，在埋栓第14天時(shí)，在早晨6：00開始給供體羊進(jìn)行超數(shù)排卵處理，每天早晚各一針，采用促卵泡素(FSH)遞減法進(jìn)行，連續(xù)8針；在埋栓的第16天晚或第17天早對(duì)受體進(jìn)行撤栓，同時(shí)肌注200～250 IU 孕馬血清促性腺激素(PMSG)；供體在埋栓的第17天時(shí)進(jìn)行撤栓，同時(shí)肌注前列腺素(PG)0.1 mg；在最后一針FSH注射完的下一個(gè)晚上進(jìn)行肌注促黃體素(LH)100 IU；于注射LH的當(dāng)天下午進(jìn)行腹腔內(nèi)輸精。在輸精后的第2天早8時(shí)進(jìn)行手術(shù)沖胚。

1.2.3 沖胚方法

采用常規(guī)手術(shù)方法沖胚，以輸精時(shí)腹腔鏡的入口為基礎(chǔ)，以一食指的粗細(xì)為準(zhǔn)，拉出子宮角進(jìn)行沖胚，一側(cè)結(jié)束還納后，再拉出另一側(cè)進(jìn)行沖胚。采用逆向沖胚法，從輸卵管傘部回收早期胚胎，在實(shí)體顯微鏡下將胚胎撿出，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因胚胎構(gòu)建。

1.3 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

青島森淼生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)基地。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用excel中的數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算進(jìn)行差異顯著性分析，以p值0.05和0.01作為顯著性檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 山羊超數(shù)排卵實(shí)驗(yàn)情況

本研究對(duì)近幾年所做的山羊超數(shù)排卵生產(chǎn)原核胚效果的影響進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。詳見表1。

表1 山羊超數(shù)排卵情況

表1為在2010～2011年進(jìn)行的4次超數(shù)排卵的試驗(yàn)效果，總體平均獲卵數(shù)為12.8枚/只。

2.2 左右卵巢排卵差異情況

對(duì)近幾年所做的山羊超數(shù)排卵過程中左右卵巢排卵情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，其效果如表2所示：

表2 山羊超數(shù)排卵中左右卵巢排卵數(shù)比較

注：P>0.05，兩者差異不顯著。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于116只個(gè)體進(jìn)行左右卵巢排卵數(shù)的比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，山羊左右兩側(cè)在排卵數(shù)上沒有差異，兩卵巢排卵數(shù)是相同的。所以，在沖胚時(shí)兩側(cè)沖胚要同樣重視。

2.3 FSH劑量對(duì)山羊超數(shù)排卵的影響

對(duì)近幾年所做的山羊超數(shù)排卵過程中，不同F(xiàn)SH劑量對(duì)超數(shù)排卵效果的影響進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。見表3。

表3 不同劑量FSH超數(shù)排卵情況比較

注：P>0.05，平均獲卵數(shù)各組間差異不顯著。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同劑量的超排效果進(jìn)行了比較(如表3)。研究表明：在試驗(yàn)羊隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)上，各組平均獲卵數(shù)和平均可用胚數(shù)差異不顯著。表明180～240 IU的FSH對(duì)山羊超排效果沒有顯著差異。黃俊成等報(bào)道[2]，同一批號(hào)的FSH劑量在其一定的劑量范圍內(nèi)變化時(shí)，對(duì)本地山羊和奶山羊的超數(shù)排卵效果影響不顯著。本研究結(jié)果與其相似。這表明，注射外源FSH可促進(jìn)卵巢中卵泡的發(fā)育、成熟，但到達(dá)一定劑量后，超數(shù)排卵效果并不隨著外源FSH量的增加而增加。一般來(lái)說，藥物用量少可以降低成本，所以在今后超排方案設(shè)計(jì)中，可以適當(dāng)降低山羊的超排用藥量。

2.4 山羊體重對(duì)超數(shù)排卵效果的影響

對(duì)近幾年所做的山羊超數(shù)排卵過程中，供體體重對(duì)超數(shù)排卵效果的影響進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，其效果如表4所示：

表4 山羊體重對(duì)超排效果的影響

注：P>0.05，各組間平均獲卵數(shù)差異不顯著。

本研究對(duì)于體重在25～45 kg的山羊進(jìn)行超排處理，以5 kg為一個(gè)梯度進(jìn)行研究。研究表明：各組之間在平均獲卵數(shù)上差異不顯著。結(jié)果表明，山羊在25～45 kg體重之間進(jìn)行超數(shù)排卵處理效果上沒有差異，都可以取得比較一致的結(jié)果。李太坤等報(bào)道[3]，30～50 kg山羊超排對(duì)超排結(jié)果沒有顯著影響。本文與之有類似的結(jié)果。所以在選擇山羊供體上，只要健康無(wú)病，體況良好，對(duì)于體重在一定范圍內(nèi)，可以不必過分苛求。有研究表明[3～5]，供體在激素劑量、純度等一定的條件下，體重稍小的山羊卵巢發(fā)育排卵的卵泡及未排卵的卵泡顯著較多，且在一定的體重范圍內(nèi)與體重呈正相關(guān)。本研究的結(jié)果也可見相同的趨勢(shì)。

表5 單位體重FSH劑量獲卵數(shù)比較

注：P>0.05，平均獲卵數(shù)，各組間差異不顯著。

對(duì)于不同F(xiàn)SH劑量與山羊的體重進(jìn)行比值，取比值范圍5.5～7.0，以0.5為梯度進(jìn)行研究。研究表明：各組之間在平均獲卵數(shù)上差異不顯著。這個(gè)指數(shù)是將超排山羊體重和超排劑量相結(jié)合，能更好地對(duì)這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行衡量，對(duì)未來(lái)設(shè)計(jì)超排方案的劑量確定有很好的借鑒意義。在不影響結(jié)果的前提下，可以減少用FSH的量，節(jié)約超數(shù)排卵成本。

2.5 不同季節(jié)超排對(duì)排卵數(shù)的影響

對(duì)近幾年所做的山羊超數(shù)排卵過程中，超排季節(jié)對(duì)超數(shù)排卵效果的影響進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。見表6。

表6 季節(jié)對(duì)山羊超排的影響

注：P>0.05，差異不顯著。

本研究對(duì)于超數(shù)排卵進(jìn)行的季節(jié)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：山羊在春季和冬季進(jìn)行的超數(shù)排卵操作時(shí)，兩季節(jié)平均獲卵數(shù)上差異不顯著。山羊是常年發(fā)情動(dòng)物，在各個(gè)季節(jié)都會(huì)發(fā)情。2001年蘇和等報(bào)道[6]，6月和12月份超排效果不好，與本研究不同。

3 結(jié)論

3.1 山羊在超數(shù)排卵時(shí)，左右卵巢排卵數(shù)差異不顯著。

3.2 山羊體重在25～50 kg之間對(duì)超排結(jié)果沒有差異。

3.3 山羊超排劑量與體重之比(IU/kg)在5.5～7.0之間效果差異不顯著，可以取得比較好的超排效果。

3.4 山羊在春季和冬季的超排效果沒有差異。

[1] 倪和民，張鴻波，劉云海，等.3個(gè)品種綿羊超數(shù)排卵處理后卵巢上促黃體素受體表達(dá)差異的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42(11)：1625-1631.

[2] 黃俊成，史洪才，楊梅，等.山羊的超排處理及影響因素的研究[J].草食家畜.2001年(增刊)：107-109.

[3] 李太坤，李文婷，鄒恒，等.山羊體重、重復(fù)超排次數(shù)對(duì)超數(shù)排卵效果的影響[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011，6：31-32.

[4] 張瑣林，王述宇.波爾山羊超數(shù)排卵方案的研究[J].中國(guó)草食動(dòng)物，2001，4：10-14.

[5] Picazo R A，Cocero M L，Barragan，et al.Effects of LH administration at the end of an FSH superovulatory regimen on ovulation rate and embryo production in three breeds of sheep[J].Theriogenology，1996，41(1)：1065-1073.

[6] 蘇和，趙霞，達(dá)來(lái).波爾山羊超數(shù)排卵技術(shù)的研究[J].內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)，2001，22，(3)：36-37.