劉景武 付素蘭 任天紅 張榮 張蕊 孫文澤

·論著·

免疫膠體金法與培養(yǎng)方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌檢測(cè)結(jié)果研究

劉景武 付素蘭 任天紅 張榮 張蕊 孫文澤

目的評(píng)價(jià)自制沙門(mén)氏菌膠體金試紙對(duì)沙門(mén)氏菌檢測(cè)的真實(shí)性、可靠性和實(shí)用性．探討其用于沙門(mén)氏菌引起的食物中毒臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值。方法用培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，并用膠體金方法對(duì)同一份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)膠體金方法的診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)作出計(jì)算。結(jié)果兩種方法的檢測(cè)結(jié)果之間有極好的一致性(Φ=0.903，Kappa=0.898)，膠體金法診斷沙門(mén)氏菌與金標(biāo)準(zhǔn)方法的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，膠體金法檢測(cè)沙門(mén)氏菌診斷試驗(yàn)的靈敏度為81.8%，特異性為100%，符合率為99.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為99.6%，假陰性率為18.2%，假陽(yáng)性率為0。結(jié)論膠體金法在基層、和突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，在對(duì)沙門(mén)氏菌檢測(cè)工作中具有一定的應(yīng)用價(jià)值．該方法的特異性高，一致性也較高，但其靈敏度仍有待提高。

沙門(mén)氏菌；免疫膠體金；培養(yǎng)；診斷試驗(yàn)

沙門(mén)氏菌是腸桿菌科中的一個(gè)重要菌屬，是人和動(dòng)物的常見(jiàn)病原菌?？梢鹑祟?lèi)多種疾病，如食物中毒、胃腸炎、菌血癥、腸熱癥等。目前，對(duì)于沙門(mén)氏菌有很多檢測(cè)方法，如免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、以及傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。但是，在應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速準(zhǔn)確的判斷病原菌，成為診療的關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7 d才能完成。而近幾年發(fā)展起來(lái)的膠體金免疫快速檢測(cè)法，是利用抗體膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)研制而成，用于定性檢測(cè)標(biāo)本中的沙門(mén)氏菌。該法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果清晰，易于判斷，可廣泛應(yīng)用于臨床和基層醫(yī)療單位對(duì)可疑沙門(mén)氏菌標(biāo)本的快速檢測(cè)[1-4]。為了探討快速法在臨床標(biāo)本中的使用價(jià)值，我們對(duì)自制的沙門(mén)氏菌免疫膠體金試紙條與培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，以確定其在沙門(mén)氏菌引起腹瀉的診斷價(jià)值，以滿(mǎn)足臨床需要。

1 材料與方法

1.1 試劑 SS、EMB購(gòu)自購(gòu)自北京市陸橋技術(shù)有限公司。沙門(mén)氏菌診斷血清購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司。細(xì)菌生化鑒定板購(gòu)自珠海迪爾生物工程有限公司。細(xì)菌生化鑒定儀購(gòu)自珠海迪爾生物工程有限公司。沙門(mén)氏菌免疫層析條由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 標(biāo)本 標(biāo)本為2011年5月至 2012年10月間，我院門(mén)診和病房腹瀉患者糞便標(biāo)本共520例。其中男性患者300例,女性220例；年齡7～75歲,平均年齡35歲。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法：取糞便標(biāo)本接種到SS、EMB培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)18～24 h，挑取可疑菌落，分離純化，同時(shí)做初步鑒定，同時(shí)用沙門(mén)氏菌多價(jià)血清(A-F)群進(jìn)行分群，最后用純化的菌做生化鑒定，用沙門(mén)氏菌診斷血清鑒定到種。

1.3.2 沙門(mén)氏菌免疫層析條檢測(cè)[5-7]：取1 g(1 ml)標(biāo)本加9 ml0.9%氯化鈉溶液混勻，500×g離心5 min。吸取上清液加入另一滅菌離心管中以14 000×g，離心10 min，沉淀用500 ml0.9%氯化鈉溶液懸浮 。在沸水中煮沸半小時(shí)。然后再用沙門(mén)氏菌免疫層析條檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照，以生理鹽水為陰性對(duì)照，結(jié)果判讀，檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)同時(shí)出現(xiàn)為陽(yáng)性，只出現(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)，為陰性，只出現(xiàn)檢測(cè)線(xiàn)，而無(wú)質(zhì)控線(xiàn)，需重做。用培養(yǎng)的方法和免疫膠體金法同時(shí)對(duì)520例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，用四格表評(píng)價(jià)免疫膠體金法檢測(cè)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用培養(yǎng)的方法和免疫膠體金法同時(shí)對(duì)520例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中培養(yǎng)的方法檢出11例陽(yáng)性標(biāo)本,509例陰性標(biāo)本,而用免疫膠體金法檢測(cè)出9份陽(yáng)性標(biāo)本, 511例陰性標(biāo)本。見(jiàn)表1。

獨(dú)立性檢驗(yàn)(pearsonx2檢驗(yàn))結(jié)果：N=520，pearsonx2=94．214，P=0.000，兩種沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法的結(jié)果不獨(dú)立，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果之間具有關(guān)聯(lián)性，其列聯(lián)系數(shù)中為0.903，可認(rèn)為兩種檢測(cè)結(jié)果之間存在正關(guān)聯(lián)性；Kappa值為0.898，表明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果之間的一致性為優(yōu)。

表1 免疫膠體金法檢測(cè)的結(jié)果與培養(yǎng)方法比較

配對(duì)設(shè)計(jì)的Mc Nemerx2檢驗(yàn)結(jié)果Mc Nemerx2P值為0.500，因此認(rèn)為膠體金法診斷沙門(mén)氏菌與金標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 常用診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的計(jì)算結(jié)果 自制沙門(mén)氏菌免疫膠體金試紙條的特異性為100%，靈敏度為81.8%。Youden指數(shù)越接近1，說(shuō)明其診斷價(jià)值越大，本試劑的Youden指數(shù)為 81.8%，說(shuō)明其診斷價(jià)值比較高。該試紙條與培養(yǎng)方法相比符合率達(dá)到99.6%。見(jiàn)表2。

表2 膠體金法診斷沙門(mén)氏菌試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)

3 討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知自制沙門(mén)氏菌膠體金試紙條與培養(yǎng)方法相比較其診斷的靈敏度為81.8%，特異性為100%，假陽(yáng)性率為0；假陰性率為18.2%，符合率達(dá)到99.6%。

目前，對(duì)于沙門(mén)氏菌有很多檢測(cè)方法，如免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、以及傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。但是，在應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速準(zhǔn)確的判斷病原菌，成為診療的關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7 d才能完成，已不能達(dá)到令人滿(mǎn)意的效果。分子生物學(xué)方法，雖然靈敏度高，可是操作繁瑣，技術(shù)性強(qiáng)，對(duì)人員要求嚴(yán)格，也不適合現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模應(yīng)用，而免疫膠體金技術(shù)，以其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、不需專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)就能滿(mǎn)足檢測(cè)的特點(diǎn)，非常適合突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速檢測(cè)目的。但是該方法靈敏度低，受方法學(xué)限制，從方法學(xué)上提高靈敏度，不太可能，所以在臨床標(biāo)本檢測(cè)中，能不能通過(guò)建立一套前處理方法，以達(dá)到去除影響因子，提高靈敏度的目的呢？本研究使用自制沙門(mén)氏菌免疫膠體金試紙條，對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)將密度梯度離心法和煮沸處理相結(jié)合，采用密度梯度離心法，去除了糞便中大部分的顆粒物，再經(jīng)過(guò)煮沸處理，菌體破裂，暴露的抗體結(jié)合位點(diǎn)增多，并且顆粒變小后，在纖維素膜上的涌動(dòng)速度變快，從而大大提高了陽(yáng)性檢出時(shí)間和檢出限，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間在一小時(shí)內(nèi)完成，基本能滿(mǎn)足突發(fā)公共衛(wèi)生事件的要求，達(dá)到快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)目的[10，11]。

膠體金方法作為一種免疫學(xué)方法具有快捷迅速，大大縮短出結(jié)果時(shí)間；操作簡(jiǎn)便，不需任何儀器和設(shè)備；試劑穩(wěn)定，外界因素影響較??；成本低廉，所需試劑和樣本量少的特點(diǎn)越來(lái)越受到科學(xué)家的關(guān)注，并成功應(yīng)用于一些臨床檢測(cè)。但是在應(yīng)用中也暴漏出一個(gè)問(wèn)題，那就是通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)膠體金法診斷沙門(mén)氏菌的靈敏度為81.8%，靈敏度則有待提高，容易造成漏診。所以在實(shí)際工作中只能做為輔助方法，不能代替培養(yǎng)的方法，在今后的工作中，我們將尋求改進(jìn)的方法提高其靈敏度。

1 諶志強(qiáng)，段惠莉，王新為，等．大腸埃希菌O157：H7的膠體金免疫滲濾法檢測(cè)．中國(guó)公共衛(wèi)生, 2005，21：705-706．

2 Duan HL，Shen ZQ，Wang XW，et al．Preparation of immunomagnetic iron-dextran nanoparticles and application in rapid isolation of E.coli O157 from foods．J World Journal of Gastroenterology，2005，11：3660-3664．

3 王中民，李君文，王新為，等．膠體金免疫層析法快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2004，32：36-38．

4 唐景峰,李曉艷.布病膠體金免疫層析檢測(cè)方法的建立.中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2007,20:119-122.

5 熊?chē)?guó)華，于莉.單增李斯特菌免疫膠體金試紙條快速檢測(cè).中國(guó)公共衛(wèi)生,2008,24:248-249.

6 賈慧，田秀梅.膠體金快速法檢測(cè)糞便幽門(mén)螺桿菌分泌蛋白的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià).吉林醫(yī)學(xué),2009,30:2629-2630.

7 王璞，陳保文.斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)抗莢膜組織胞漿茵抗體的研究.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29:1979-1981.

8 李少彤，欒玉明.膠體金法快速檢測(cè)霍亂弧菌診斷試驗(yàn)的研究設(shè)計(jì)與分析.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16:269-271.

9 許青田,崔中鋒.膠體金標(biāo)記免疫層析法快速診斷霍亂臨床研究.中國(guó)誤診學(xué)雜志,2002,2:900-901.

10 劉景武，付素蘭，任天紅，等.沙門(mén)氏菌膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)腹瀉病人糞便中沙門(mén)氏菌的研究.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24:66-67.

11 劉景武，付素蘭，任天紅，等.沙門(mén)氏菌膠體金免疫層析試紙條的研制.河北醫(yī)藥，2013，35:3493-3494.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.024

050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科

R 378.22

A

1002-7386(2014)07-1021-02

2013-10-30)