昝麗霞等

摘要：應(yīng)用植物解剖學(xué)、組織化學(xué)定位及植物化學(xué)技術(shù)，研究了盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）的解剖結(jié)構(gòu)特征與皂苷積累的關(guān)系。結(jié)果表明，盾葉薯蕷根狀莖主要由周皮、基本組織和散生的維管束構(gòu)成。對盾葉薯蕷成熟根狀莖的組織化學(xué)研究和對薯蕷皂苷元的含量測定結(jié)果一致，薯蕷皂苷主要存在于基本組織的薄壁細(xì)胞中，韌皮部的生活細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞有薯蕷皂苷的積累，粗壯的比纖細(xì)的根狀莖中皂苷含量高，根狀莖中段比兩側(cè)的皂苷含量高。

關(guān)鍵詞：盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）；根狀莖；皂苷；組織化學(xué)；測定

中圖分類號：Q949.95 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3103-03

Localization and Determination of Saponin in Rhizome of Dioscorea zingiberensis

ZAN Li-xia，XU Hao，ZHAO Hua，LI Hui-ning

（College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723000， Shaanxi， China）

Abstract： Anatomical， histochemical and phytochemical methods were used to investigate the structure， the localization and content changes of saponin in rhizome of Dioscoreae zingiberensis. Results showed that rhizome was composed of periderm， ground tissue and scattered vascular bundles. Diosgenin was mainly in the basic organization of parenchyma cells， and accumulated in living cells and bundle sheath cells of phloem. The diosgenin contents in the stout rhizomes was more than in the slender.

Key words： Dioscorea zingiberensis； rhizome； saponin； histochemistry； determination

盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis）又名黃姜，是薯蕷科薯蕷屬多年生草本植物。以根狀莖入藥，具有清肺止咳、利濕通淋、通絡(luò)止痛、解毒消腫的功能，同時具有治療皮膚急性化膿性感染、軟組織損傷、降血脂等功效，也有降低膽固醇、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。其根莖中薯蕷皂苷元是合成甾體激素類藥物和甾體避孕藥的重要醫(yī)藥化工原料。

目前，對于盾葉薯蕷的研究大多集中在提取分離、解剖、胚胎、生理等方面[1-4]。肖冰梅等[5]、曹玉芳等[6]主要從形態(tài)發(fā)育解剖方面對盾葉薯蕷進行研究。本試驗對盾葉薯蕷根狀莖的解剖結(jié)構(gòu)和皂苷元積累的關(guān)系進行研究，旨在為盾葉薯蕷藥用植物的質(zhì)量控制和快速檢測提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、儀器和試劑

試驗材料盾葉薯蕷于2012年采自安康市旬陽縣劉家灣、宋家?guī)X、郭家灣。

儀器：Nikon ECLIPSE E600型顯微鏡、Nikon SMZ800型解剖鏡、YL3-A型迴轉(zhuǎn)式切片機（上海儀表廠）、1260型高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司）、101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

試劑：FAA固定液（50%乙醇∶甲醛∶冰醋酸=890∶50∶60）、1%番紅染液、1%固綠染液、無水乙醇、二甲苯、1%酰胺黑、碘液、蘇丹Ⅲ染色、5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑、氫氧化鈉、碘-碘化鉀、冰醋酸、明膠黏片劑、石蠟等，均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)解剖學(xué)方法 選擇生長健壯的盾葉薯蕷根狀莖用FAA固定液固定，經(jīng)乙醇系列脫水、透蠟、包埋、常規(guī)石蠟制片。切片厚度8～10 μm，黏片、脫蠟，用番紅-固綠對染法染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并照相。

1.2.2 皂苷的組織化學(xué)定位 將新鮮材料用徒手切片，放置于載玻片上滴加等量的5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑，對盾葉薯蕷的皂苷類物質(zhì)進行組織化學(xué)定位[7]，顯色后在Nikon ECLIPSE E600型顯微鏡下觀察并照相。陰性對照采用FAA固定液浸泡1個月的材料同樣方法制片觀察。

1.2.3 貯藏物的組織化學(xué)定位[8]

1）常規(guī)石蠟切片，厚度8～10 μm，用1%酰胺黑染色，鑒定蛋白質(zhì)；用碘液染色，鑒定淀粉。

2）采用5%氫氧化鈉顯色劑對盾葉薯蕷中的黃酮類物質(zhì)進行組織化學(xué)定位。

3）根據(jù)生物堿與碘化鉍鉀（Dragendorff）和濃硝酸產(chǎn)生顏色反應(yīng)的原理，用改良的碘化鉍鉀試劑（由0.85 g次硝酸鉍溶于10 mL冰醋酸和40 mL去離子水后，再與20 mL 40%的碘化鉀混合而成）處理5 min鑒定生物堿。

以上各處理用Nikon ECLIPSE E600型顯微鏡觀察并照相。

1.2.4 盾葉薯蕷皂苷元含量的測定

1）對照品制備。精確稱取盾葉薯蕷皂苷元對照品5.40 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度，搖勻，制成0.18 mg/mL的對照品儲備液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，冰箱保存，備用。

2）色譜條件。色譜柱：HiQsil C18柱（250 mm× 4.6 mm，10 μm），流動相為甲醇-水（90∶10）（V∶V），流速為0.8 mL/min，柱溫為室溫。

3）樣品溶液的制備。取干燥盾葉薯蕷樣品5.00 g，精確稱量，置于250 mL圓底燒瓶中，加適量超純水潤濕，超聲預(yù)處理20 min，加入2 mol/L硫酸溶液100 mL，在100 ℃水浴中水解4 h，冷卻、過濾，殘渣用去離子水洗至中性，收集殘渣，60 ℃干燥，干燥后的粉末置于水浴中，40 ℃條件下用石油醚（沸程30～60 ℃）提取5 h，提取液揮發(fā)掉溶劑后真空干燥，得到盾葉薯蕷總皂苷元粗提取物，加甲醇使其溶解，定容至10 mL，搖勻，作為供試樣品溶液。

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取對照品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，定容至10 mL，搖勻，得到5個不同濃度梯度的溶液。按上述色譜條件分別進樣10 μL，進樣時間20 min，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=5.364 4X+18.245，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8。

5）精密度試驗。吸取上述對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算得到精密度RSD=1.41%。

6）重復(fù)性試驗。取樣品共6份，精確稱重3.0 g，按上述方法測定樣品中盾葉薯蕷皂苷元的平均含量（n=6），計算得到RSD=1.22%。

7）穩(wěn)定性試驗。取樣品按上述方法制備樣品溶液，放置0、2、4、6、8、10 h，各精確進樣10 μL，測定薯蕷皂苷元峰面積，計算得到RSD=1.24%。

2 結(jié)果與分析

2.1 盾葉薯蕷根狀莖橫切面的結(jié)構(gòu)

盾葉薯蕷根狀莖橫切面的結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)由周皮、基本組織和分散在基本組織中的維管束組成（圖1a）。根狀莖的保護組織由周皮及其外的殘留表皮和薄壁組織構(gòu)成。表面的5～6層細(xì)胞體積較大，略呈圓形，排列不整齊，外側(cè)的細(xì)胞破碎（圖1b）。這些細(xì)胞是周皮在基本組織內(nèi)產(chǎn)生后，其外側(cè)的表皮和薄壁組織的殘留，其內(nèi)的5～7層細(xì)胞排列整齊，呈長方形，體積小，屬于周皮。其中外側(cè)3～5層為木栓層細(xì)胞，細(xì)胞壁栓質(zhì)化，其內(nèi)為木栓形成層和栓內(nèi)層細(xì)胞。根狀莖的周皮以內(nèi)是基本組織，維管束散生其中，因此其基本組織缺乏皮層、髓等劃分。

在根狀莖的基本組織的中部（8～10層細(xì)胞處）含有針晶的黏液細(xì)胞（圖1c、d），其針晶成束，長60～80 μm。黏液細(xì)胞常單獨存在，少數(shù)相鄰，在基本組織內(nèi)排列成不連續(xù)的1圈。在上述外部區(qū)域的基本組織內(nèi)，無維管束分布。其內(nèi)為基本組織的內(nèi)部區(qū)域，占根狀莖橫切面面積的90%左右，維管束散生在此部分基本組織內(nèi)。此區(qū)域的基本組織都是薄壁組織細(xì)胞，其細(xì)胞體積較外區(qū)的略大，細(xì)胞也呈等徑、近圓形，大小不一，內(nèi)含物較多。

根狀莖的維管束散生在內(nèi)部區(qū)域的基本組織內(nèi)（圖1e、f）。此區(qū)域的邊緣部分中，維管束較小，排列成不規(guī)則的兩輪，其中外輪維管束數(shù)量較多，排列較緊密；內(nèi)輪數(shù)量較少，排列較稀疏。中央部分內(nèi)的維管束較大，其外側(cè)的維管束排列成1輪，每個維管束都由1～2層維管束鞘包圍著初生木質(zhì)部和韌皮部構(gòu)成。維管束鞘是由厚壁組織細(xì)胞組成。初生木質(zhì)部在內(nèi)側(cè)，初生韌皮部在外側(cè)，兩者間有少數(shù)較大的薄壁細(xì)胞。后生木質(zhì)部由10～16個大口徑導(dǎo)管構(gòu)成，有的中間被小口徑導(dǎo)管分隔開，其內(nèi)側(cè)的導(dǎo)管較小，為原生木質(zhì)部；后生韌皮部由篩管、伴胞和薄壁組織細(xì)胞構(gòu)成，其外側(cè)為少數(shù)原生韌皮部篩管，有的維管束內(nèi)其篩管已被擠掉。小的維管束也由厚壁組織鞘包圍，但其初生木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的數(shù)量較少。

2.2 盾葉薯蕷根狀莖組織化學(xué)定位

盾葉薯蕷根狀莖中總皂苷與5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑反應(yīng)呈淡紅和紫紅色，陰性對照制片與皂苷顯色劑不發(fā)生顯色反應(yīng)。

在盾葉薯蕷有維管束分布的基本組織內(nèi)，組織細(xì)胞中薯蕷皂苷的積累與分布最豐富，細(xì)胞中的紅色液滴數(shù)量多且密集。小型維管束分布部位的基本組織顯色最明顯，顯示此處含皂苷量最高；在大型維管束分布的部位，基本組織中紅色液滴相對較少。在基本組織薄壁細(xì)胞內(nèi)側(cè)，整個細(xì)胞呈淺紅色，顯色較均勻；韌皮部的篩管、伴胞和薄壁組織細(xì)胞以及維管束鞘細(xì)胞中都有薯蕷皂苷的積累和分布。木質(zhì)部細(xì)胞和韌皮部的韌皮纖維中無顯色反應(yīng)；在木栓層及其殘留并栓化的表皮和薄壁組織構(gòu)成的保護組織的細(xì)胞內(nèi)也無顯色反應(yīng)。

對儲藏物組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，通過碘液染色，淀粉主要存在于薄壁組織的整個細(xì)胞中，含量較多，被染成藍色；用1%酰胺黑染色，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)被染成藍色，蛋白質(zhì)主要分布在薄壁細(xì)胞內(nèi)壁上，且含量較少。而通過用碘液對淀粉的染色發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)呈黃色，主要存在于薄壁組織細(xì)胞壁及篩管中。

生物堿與碘-碘化鉀試劑反應(yīng)顯棕色或者棕褐色，在基本組織內(nèi)，外部沒有維管束分布的部分，整個細(xì)胞顯淺棕色，顯色較均勻。而周皮部分的細(xì)胞顯棕色，周皮內(nèi)的15～18層細(xì)胞為薄壁組織細(xì)胞沒有顯棕色，在含有維管束部分的細(xì)胞中，維管束顯棕褐色，其周圍的薄壁組織不顯棕色，因此推斷，生物堿主要存在于周皮及維管束中。黃酮能與5%氫氧化鈉反應(yīng)顯黃色，參照盾葉薯蕷的解剖結(jié)構(gòu)對盾葉薯蕷根狀莖中的黃酮進行組織化學(xué)定位，經(jīng)觀察，未發(fā)現(xiàn)黃色，表明不存在黃酮。

3 討論

盾葉薯蕷根狀莖中含有多種結(jié)構(gòu)相似的皂苷成分，水解后成為薯蕷皂苷元。由于皂苷類成分通常分布于薄壁組織細(xì)胞中，不同藥材皂苷的分布由于結(jié)構(gòu)及發(fā)育時期的差異存在一定區(qū)別。組化研究中根據(jù)特定的顯色劑能與薯蕷皂苷發(fā)生作用，生成大分子復(fù)合物顯示出特定的顏色反應(yīng)，并且顏色的深淺與薯蕷皂苷的含量呈正相關(guān)。本試驗對盾葉薯蕷成熟根狀莖的組織化學(xué)研究和對薯蕷皂苷元的含量測定結(jié)果一致，表明皂苷主要存在于分化完成的維管束周圍基本組織內(nèi)部，粗壯的比纖細(xì)的根狀莖中皂苷含量高，根狀莖中段比兩側(cè)的皂苷含量高。

參考文獻：

[1] 楊春月，朱靖博，王振中，等.復(fù)合乳化劑對黃姜薯蕷皂苷在水中分布的影響[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（2）：27-30.

[2] 趙 敏，譚大維，余河水，等.薯蕷皂苷元的制備方法研究進展[J].中草藥，2013，44（13）：1860-1866.

[3] 蘆 婕，張曉麗，劉 雯，等.外植體和植物生長調(diào)節(jié)劑對盾葉薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（15）： 3693-3696.

[4] 何 炎，王繼雙，張 鵬，等.薯蕷皂苷元聯(lián)合TRAIL對非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞的協(xié)同作用及其中效原理評價[J].藥學(xué)學(xué)報，2013，48（1）：45-51.

[5] 肖冰梅，盛孝邦，彭 菲，等.9種薯蕷屬藥用植物的組織化學(xué)研究[J].中華醫(yī)藥雜志，2007，7（7）：601-602.

[6] 曹玉芳，林 如，胡正海.盾葉薯蕷根狀莖的發(fā)育解剖學(xué)和組織化學(xué)研究[J].武漢植物學(xué)研究，2003，21（4）：288-294.

[7] 彭華勝，劉文哲，胡正海，等.栽培太子參塊根中皂苷的組織化學(xué)定位及其含量變化[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報，2009，42（1）：1-5.

[8] 楊星宇，吳春紅，楊建明.盾葉薯蕷形態(tài)解剖和皂甙的組織化學(xué)定位及含量變化[J].湖北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，29（2）：182-185.

2）色譜條件。色譜柱：HiQsil C18柱（250 mm× 4.6 mm，10 μm），流動相為甲醇-水（90∶10）（V∶V），流速為0.8 mL/min，柱溫為室溫。

3）樣品溶液的制備。取干燥盾葉薯蕷樣品5.00 g，精確稱量，置于250 mL圓底燒瓶中，加適量超純水潤濕，超聲預(yù)處理20 min，加入2 mol/L硫酸溶液100 mL，在100 ℃水浴中水解4 h，冷卻、過濾，殘渣用去離子水洗至中性，收集殘渣，60 ℃干燥，干燥后的粉末置于水浴中，40 ℃條件下用石油醚（沸程30～60 ℃）提取5 h，提取液揮發(fā)掉溶劑后真空干燥，得到盾葉薯蕷總皂苷元粗提取物，加甲醇使其溶解，定容至10 mL，搖勻，作為供試樣品溶液。

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取對照品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，定容至10 mL，搖勻，得到5個不同濃度梯度的溶液。按上述色譜條件分別進樣10 μL，進樣時間20 min，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=5.364 4X+18.245，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8。

5）精密度試驗。吸取上述對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算得到精密度RSD=1.41%。

6）重復(fù)性試驗。取樣品共6份，精確稱重3.0 g，按上述方法測定樣品中盾葉薯蕷皂苷元的平均含量（n=6），計算得到RSD=1.22%。

7）穩(wěn)定性試驗。取樣品按上述方法制備樣品溶液，放置0、2、4、6、8、10 h，各精確進樣10 μL，測定薯蕷皂苷元峰面積，計算得到RSD=1.24%。

2 結(jié)果與分析

2.1 盾葉薯蕷根狀莖橫切面的結(jié)構(gòu)

盾葉薯蕷根狀莖橫切面的結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)由周皮、基本組織和分散在基本組織中的維管束組成（圖1a）。根狀莖的保護組織由周皮及其外的殘留表皮和薄壁組織構(gòu)成。表面的5～6層細(xì)胞體積較大，略呈圓形，排列不整齊，外側(cè)的細(xì)胞破碎（圖1b）。這些細(xì)胞是周皮在基本組織內(nèi)產(chǎn)生后，其外側(cè)的表皮和薄壁組織的殘留，其內(nèi)的5～7層細(xì)胞排列整齊，呈長方形，體積小，屬于周皮。其中外側(cè)3～5層為木栓層細(xì)胞，細(xì)胞壁栓質(zhì)化，其內(nèi)為木栓形成層和栓內(nèi)層細(xì)胞。根狀莖的周皮以內(nèi)是基本組織，維管束散生其中，因此其基本組織缺乏皮層、髓等劃分。

在根狀莖的基本組織的中部（8～10層細(xì)胞處）含有針晶的黏液細(xì)胞（圖1c、d），其針晶成束，長60～80 μm。黏液細(xì)胞常單獨存在，少數(shù)相鄰，在基本組織內(nèi)排列成不連續(xù)的1圈。在上述外部區(qū)域的基本組織內(nèi)，無維管束分布。其內(nèi)為基本組織的內(nèi)部區(qū)域，占根狀莖橫切面面積的90%左右，維管束散生在此部分基本組織內(nèi)。此區(qū)域的基本組織都是薄壁組織細(xì)胞，其細(xì)胞體積較外區(qū)的略大，細(xì)胞也呈等徑、近圓形，大小不一，內(nèi)含物較多。

根狀莖的維管束散生在內(nèi)部區(qū)域的基本組織內(nèi)（圖1e、f）。此區(qū)域的邊緣部分中，維管束較小，排列成不規(guī)則的兩輪，其中外輪維管束數(shù)量較多，排列較緊密；內(nèi)輪數(shù)量較少，排列較稀疏。中央部分內(nèi)的維管束較大，其外側(cè)的維管束排列成1輪，每個維管束都由1～2層維管束鞘包圍著初生木質(zhì)部和韌皮部構(gòu)成。維管束鞘是由厚壁組織細(xì)胞組成。初生木質(zhì)部在內(nèi)側(cè)，初生韌皮部在外側(cè)，兩者間有少數(shù)較大的薄壁細(xì)胞。后生木質(zhì)部由10～16個大口徑導(dǎo)管構(gòu)成，有的中間被小口徑導(dǎo)管分隔開，其內(nèi)側(cè)的導(dǎo)管較小，為原生木質(zhì)部；后生韌皮部由篩管、伴胞和薄壁組織細(xì)胞構(gòu)成，其外側(cè)為少數(shù)原生韌皮部篩管，有的維管束內(nèi)其篩管已被擠掉。小的維管束也由厚壁組織鞘包圍，但其初生木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的數(shù)量較少。

2.2 盾葉薯蕷根狀莖組織化學(xué)定位

盾葉薯蕷根狀莖中總皂苷與5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑反應(yīng)呈淡紅和紫紅色，陰性對照制片與皂苷顯色劑不發(fā)生顯色反應(yīng)。

在盾葉薯蕷有維管束分布的基本組織內(nèi)，組織細(xì)胞中薯蕷皂苷的積累與分布最豐富，細(xì)胞中的紅色液滴數(shù)量多且密集。小型維管束分布部位的基本組織顯色最明顯，顯示此處含皂苷量最高；在大型維管束分布的部位，基本組織中紅色液滴相對較少。在基本組織薄壁細(xì)胞內(nèi)側(cè)，整個細(xì)胞呈淺紅色，顯色較均勻；韌皮部的篩管、伴胞和薄壁組織細(xì)胞以及維管束鞘細(xì)胞中都有薯蕷皂苷的積累和分布。木質(zhì)部細(xì)胞和韌皮部的韌皮纖維中無顯色反應(yīng)；在木栓層及其殘留并栓化的表皮和薄壁組織構(gòu)成的保護組織的細(xì)胞內(nèi)也無顯色反應(yīng)。

對儲藏物組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，通過碘液染色，淀粉主要存在于薄壁組織的整個細(xì)胞中，含量較多，被染成藍色；用1%酰胺黑染色，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)被染成藍色，蛋白質(zhì)主要分布在薄壁細(xì)胞內(nèi)壁上，且含量較少。而通過用碘液對淀粉的染色發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)呈黃色，主要存在于薄壁組織細(xì)胞壁及篩管中。

生物堿與碘-碘化鉀試劑反應(yīng)顯棕色或者棕褐色，在基本組織內(nèi)，外部沒有維管束分布的部分，整個細(xì)胞顯淺棕色，顯色較均勻。而周皮部分的細(xì)胞顯棕色，周皮內(nèi)的15～18層細(xì)胞為薄壁組織細(xì)胞沒有顯棕色，在含有維管束部分的細(xì)胞中，維管束顯棕褐色，其周圍的薄壁組織不顯棕色，因此推斷，生物堿主要存在于周皮及維管束中。黃酮能與5%氫氧化鈉反應(yīng)顯黃色，參照盾葉薯蕷的解剖結(jié)構(gòu)對盾葉薯蕷根狀莖中的黃酮進行組織化學(xué)定位，經(jīng)觀察，未發(fā)現(xiàn)黃色，表明不存在黃酮。

3 討論

盾葉薯蕷根狀莖中含有多種結(jié)構(gòu)相似的皂苷成分，水解后成為薯蕷皂苷元。由于皂苷類成分通常分布于薄壁組織細(xì)胞中，不同藥材皂苷的分布由于結(jié)構(gòu)及發(fā)育時期的差異存在一定區(qū)別。組化研究中根據(jù)特定的顯色劑能與薯蕷皂苷發(fā)生作用，生成大分子復(fù)合物顯示出特定的顏色反應(yīng)，并且顏色的深淺與薯蕷皂苷的含量呈正相關(guān)。本試驗對盾葉薯蕷成熟根狀莖的組織化學(xué)研究和對薯蕷皂苷元的含量測定結(jié)果一致，表明皂苷主要存在于分化完成的維管束周圍基本組織內(nèi)部，粗壯的比纖細(xì)的根狀莖中皂苷含量高，根狀莖中段比兩側(cè)的皂苷含量高。

參考文獻：

[1] 楊春月，朱靖博，王振中，等.復(fù)合乳化劑對黃姜薯蕷皂苷在水中分布的影響[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（2）：27-30.

[2] 趙 敏，譚大維，余河水，等.薯蕷皂苷元的制備方法研究進展[J].中草藥，2013，44（13）：1860-1866.

[3] 蘆 婕，張曉麗，劉 雯，等.外植體和植物生長調(diào)節(jié)劑對盾葉薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（15）： 3693-3696.

[4] 何 炎，王繼雙，張 鵬，等.薯蕷皂苷元聯(lián)合TRAIL對非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞的協(xié)同作用及其中效原理評價[J].藥學(xué)學(xué)報，2013，48（1）：45-51.

[5] 肖冰梅，盛孝邦，彭 菲，等.9種薯蕷屬藥用植物的組織化學(xué)研究[J].中華醫(yī)藥雜志，2007，7（7）：601-602.

[6] 曹玉芳，林 如，胡正海.盾葉薯蕷根狀莖的發(fā)育解剖學(xué)和組織化學(xué)研究[J].武漢植物學(xué)研究，2003，21（4）：288-294.

[7] 彭華勝，劉文哲，胡正海，等.栽培太子參塊根中皂苷的組織化學(xué)定位及其含量變化[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報，2009，42（1）：1-5.

[8] 楊星宇，吳春紅，楊建明.盾葉薯蕷形態(tài)解剖和皂甙的組織化學(xué)定位及含量變化[J].湖北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，29（2）：182-185.

2）色譜條件。色譜柱：HiQsil C18柱（250 mm× 4.6 mm，10 μm），流動相為甲醇-水（90∶10）（V∶V），流速為0.8 mL/min，柱溫為室溫。

3）樣品溶液的制備。取干燥盾葉薯蕷樣品5.00 g，精確稱量，置于250 mL圓底燒瓶中，加適量超純水潤濕，超聲預(yù)處理20 min，加入2 mol/L硫酸溶液100 mL，在100 ℃水浴中水解4 h，冷卻、過濾，殘渣用去離子水洗至中性，收集殘渣，60 ℃干燥，干燥后的粉末置于水浴中，40 ℃條件下用石油醚（沸程30～60 ℃）提取5 h，提取液揮發(fā)掉溶劑后真空干燥，得到盾葉薯蕷總皂苷元粗提取物，加甲醇使其溶解，定容至10 mL，搖勻，作為供試樣品溶液。

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取對照品溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，定容至10 mL，搖勻，得到5個不同濃度梯度的溶液。按上述色譜條件分別進樣10 μL，進樣時間20 min，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=5.364 4X+18.245，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8。

5）精密度試驗。吸取上述對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，計算得到精密度RSD=1.41%。

6）重復(fù)性試驗。取樣品共6份，精確稱重3.0 g，按上述方法測定樣品中盾葉薯蕷皂苷元的平均含量（n=6），計算得到RSD=1.22%。

7）穩(wěn)定性試驗。取樣品按上述方法制備樣品溶液，放置0、2、4、6、8、10 h，各精確進樣10 μL，測定薯蕷皂苷元峰面積，計算得到RSD=1.24%。

2 結(jié)果與分析

2.1 盾葉薯蕷根狀莖橫切面的結(jié)構(gòu)

盾葉薯蕷根狀莖橫切面的結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)由周皮、基本組織和分散在基本組織中的維管束組成（圖1a）。根狀莖的保護組織由周皮及其外的殘留表皮和薄壁組織構(gòu)成。表面的5～6層細(xì)胞體積較大，略呈圓形，排列不整齊，外側(cè)的細(xì)胞破碎（圖1b）。這些細(xì)胞是周皮在基本組織內(nèi)產(chǎn)生后，其外側(cè)的表皮和薄壁組織的殘留，其內(nèi)的5～7層細(xì)胞排列整齊，呈長方形，體積小，屬于周皮。其中外側(cè)3～5層為木栓層細(xì)胞，細(xì)胞壁栓質(zhì)化，其內(nèi)為木栓形成層和栓內(nèi)層細(xì)胞。根狀莖的周皮以內(nèi)是基本組織，維管束散生其中，因此其基本組織缺乏皮層、髓等劃分。

在根狀莖的基本組織的中部（8～10層細(xì)胞處）含有針晶的黏液細(xì)胞（圖1c、d），其針晶成束，長60～80 μm。黏液細(xì)胞常單獨存在，少數(shù)相鄰，在基本組織內(nèi)排列成不連續(xù)的1圈。在上述外部區(qū)域的基本組織內(nèi)，無維管束分布。其內(nèi)為基本組織的內(nèi)部區(qū)域，占根狀莖橫切面面積的90%左右，維管束散生在此部分基本組織內(nèi)。此區(qū)域的基本組織都是薄壁組織細(xì)胞，其細(xì)胞體積較外區(qū)的略大，細(xì)胞也呈等徑、近圓形，大小不一，內(nèi)含物較多。

根狀莖的維管束散生在內(nèi)部區(qū)域的基本組織內(nèi)（圖1e、f）。此區(qū)域的邊緣部分中，維管束較小，排列成不規(guī)則的兩輪，其中外輪維管束數(shù)量較多，排列較緊密；內(nèi)輪數(shù)量較少，排列較稀疏。中央部分內(nèi)的維管束較大，其外側(cè)的維管束排列成1輪，每個維管束都由1～2層維管束鞘包圍著初生木質(zhì)部和韌皮部構(gòu)成。維管束鞘是由厚壁組織細(xì)胞組成。初生木質(zhì)部在內(nèi)側(cè)，初生韌皮部在外側(cè)，兩者間有少數(shù)較大的薄壁細(xì)胞。后生木質(zhì)部由10～16個大口徑導(dǎo)管構(gòu)成，有的中間被小口徑導(dǎo)管分隔開，其內(nèi)側(cè)的導(dǎo)管較小，為原生木質(zhì)部；后生韌皮部由篩管、伴胞和薄壁組織細(xì)胞構(gòu)成，其外側(cè)為少數(shù)原生韌皮部篩管，有的維管束內(nèi)其篩管已被擠掉。小的維管束也由厚壁組織鞘包圍，但其初生木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞的數(shù)量較少。

2.2 盾葉薯蕷根狀莖組織化學(xué)定位

盾葉薯蕷根狀莖中總皂苷與5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合試劑反應(yīng)呈淡紅和紫紅色，陰性對照制片與皂苷顯色劑不發(fā)生顯色反應(yīng)。

在盾葉薯蕷有維管束分布的基本組織內(nèi)，組織細(xì)胞中薯蕷皂苷的積累與分布最豐富，細(xì)胞中的紅色液滴數(shù)量多且密集。小型維管束分布部位的基本組織顯色最明顯，顯示此處含皂苷量最高；在大型維管束分布的部位，基本組織中紅色液滴相對較少。在基本組織薄壁細(xì)胞內(nèi)側(cè)，整個細(xì)胞呈淺紅色，顯色較均勻；韌皮部的篩管、伴胞和薄壁組織細(xì)胞以及維管束鞘細(xì)胞中都有薯蕷皂苷的積累和分布。木質(zhì)部細(xì)胞和韌皮部的韌皮纖維中無顯色反應(yīng)；在木栓層及其殘留并栓化的表皮和薄壁組織構(gòu)成的保護組織的細(xì)胞內(nèi)也無顯色反應(yīng)。

對儲藏物組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，通過碘液染色，淀粉主要存在于薄壁組織的整個細(xì)胞中，含量較多，被染成藍色；用1%酰胺黑染色，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)被染成藍色，蛋白質(zhì)主要分布在薄壁細(xì)胞內(nèi)壁上，且含量較少。而通過用碘液對淀粉的染色發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)呈黃色，主要存在于薄壁組織細(xì)胞壁及篩管中。

生物堿與碘-碘化鉀試劑反應(yīng)顯棕色或者棕褐色，在基本組織內(nèi)，外部沒有維管束分布的部分，整個細(xì)胞顯淺棕色，顯色較均勻。而周皮部分的細(xì)胞顯棕色，周皮內(nèi)的15～18層細(xì)胞為薄壁組織細(xì)胞沒有顯棕色，在含有維管束部分的細(xì)胞中，維管束顯棕褐色，其周圍的薄壁組織不顯棕色，因此推斷，生物堿主要存在于周皮及維管束中。黃酮能與5%氫氧化鈉反應(yīng)顯黃色，參照盾葉薯蕷的解剖結(jié)構(gòu)對盾葉薯蕷根狀莖中的黃酮進行組織化學(xué)定位，經(jīng)觀察，未發(fā)現(xiàn)黃色，表明不存在黃酮。

3 討論

盾葉薯蕷根狀莖中含有多種結(jié)構(gòu)相似的皂苷成分，水解后成為薯蕷皂苷元。由于皂苷類成分通常分布于薄壁組織細(xì)胞中，不同藥材皂苷的分布由于結(jié)構(gòu)及發(fā)育時期的差異存在一定區(qū)別。組化研究中根據(jù)特定的顯色劑能與薯蕷皂苷發(fā)生作用，生成大分子復(fù)合物顯示出特定的顏色反應(yīng)，并且顏色的深淺與薯蕷皂苷的含量呈正相關(guān)。本試驗對盾葉薯蕷成熟根狀莖的組織化學(xué)研究和對薯蕷皂苷元的含量測定結(jié)果一致，表明皂苷主要存在于分化完成的維管束周圍基本組織內(nèi)部，粗壯的比纖細(xì)的根狀莖中皂苷含量高，根狀莖中段比兩側(cè)的皂苷含量高。

參考文獻：

[1] 楊春月，朱靖博，王振中，等.復(fù)合乳化劑對黃姜薯蕷皂苷在水中分布的影響[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（2）：27-30.

[2] 趙 敏，譚大維，余河水，等.薯蕷皂苷元的制備方法研究進展[J].中草藥，2013，44（13）：1860-1866.

[3] 蘆 婕，張曉麗，劉 雯，等.外植體和植物生長調(diào)節(jié)劑對盾葉薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（15）： 3693-3696.

[4] 何 炎，王繼雙，張 鵬，等.薯蕷皂苷元聯(lián)合TRAIL對非小細(xì)胞肺癌 A549 細(xì)胞的協(xié)同作用及其中效原理評價[J].藥學(xué)學(xué)報，2013，48（1）：45-51.

[5] 肖冰梅，盛孝邦，彭 菲，等.9種薯蕷屬藥用植物的組織化學(xué)研究[J].中華醫(yī)藥雜志，2007，7（7）：601-602.

[6] 曹玉芳，林 如，胡正海.盾葉薯蕷根狀莖的發(fā)育解剖學(xué)和組織化學(xué)研究[J].武漢植物學(xué)研究，2003，21（4）：288-294.

[7] 彭華勝，劉文哲，胡正海，等.栽培太子參塊根中皂苷的組織化學(xué)定位及其含量變化[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報，2009，42（1）：1-5.

[8] 楊星宇，吳春紅，楊建明.盾葉薯蕷形態(tài)解剖和皂甙的組織化學(xué)定位及含量變化[J].湖北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，29（2）：182-185.