宋海澄,宋 丁,于 萍,王 健,王潔蕊,舒 榮,韓依軒, 楊文浩,袁 偉 劉白鷺,李 娜, 崔劉福*

(1.河北聯(lián)合大學(xué)附屬開(kāi)灤總醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科,河北 唐山063000;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，吉林 長(zhǎng)春130033)

強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一種以骶髂關(guān)節(jié)、脊柱炎癥和骨壞死伴發(fā)新骨形成的慢性炎癥性疾病，通常發(fā)生在中軸骨骼，進(jìn)行性加重導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直和功能喪失。TNF-α在炎性關(guān)節(jié)疾病中的作用已為人們所熟知，并且TNF-α抑制劑已成功用于AS的臨床治療。盡管如此，仍有40%患者不能達(dá)到臨床緩解[1]，這就促使人們開(kāi)始探索是否還有其他的炎癥因子參與AS的發(fā)生和發(fā)展，以期找到新的治療靶點(diǎn)。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種間接反映感染、損傷、炎癥的有效的致炎因子[2]。在關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中已經(jīng)證實(shí)HMGB1的水平升高[3]。并且向?qū)嶒?yàn)鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射HMGB1可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎[4]。這些證據(jù)均表明HMGB1在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中可能起著重要的作用。另外，對(duì)HMGB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與TNF-α之間存在瀑布效應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致炎癥不斷放大。所以，我們檢測(cè)了AS患者和健康人群外周血中HMGB1和TNF-α的水平，以期探討HMGB1在AS發(fā)病中的作用以及與TNF-α關(guān)系，為AS發(fā)病機(jī)制的研究及尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象

本研究共納入AS患者50例，均來(lái)自河北聯(lián)合大學(xué)附屬開(kāi)灤總醫(yī)院住院和門(mén)診病人?；颊呒膊』顒?dòng)采用Bath AS Disease Activity Index (BASDAI；0-10)評(píng)分，BASDAI評(píng)分≥4表示疾病活動(dòng)。軀體功能測(cè)定采用Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index (BASFI；0-10)評(píng)分。所有病例HLA-B27均陽(yáng)性，并符合1984年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)，并除外其他自身免疫性疾病、肝腎疾病、感染、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病。其中首診未經(jīng)治療的疾病活動(dòng)期患者30例(男25例，女5例；平均年齡28.2±8.8 歲)。首診經(jīng)治3個(gè)月且無(wú)病情活動(dòng)者20例(男17例，女3例，平均年齡28.4±10.6歲)，其中7例接受依納西普聯(lián)合緩解病情藥物(DMARDs)治療，9名患者接受非甾體抗炎藥(NSAIDs)聯(lián)合DMARDs治療，4名患者接受糖皮質(zhì)激素(研究期間，強(qiáng)的松5-7.5 mg/D)聯(lián)合DMARDs治療。從同地區(qū)選取性別、年齡和種族與疾病組匹配的正常志愿者30例作為健康對(duì)照(男性26人，女性4人；平均年齡29.7±10.5歲)，無(wú)免疫性疾病，無(wú)高血壓、冠心病、糖尿病等慢性疾病，超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)、血沉(ESR)、血小板計(jì)數(shù)(Plt)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血脂、血糖、肝功能、腎功能檢測(cè)結(jié)果均在參考范圍內(nèi)，HLA-B27均呈陰性。本研究已通過(guò)河北聯(lián)合大學(xué)附屬開(kāi)灤總醫(yī)院倫理委員會(huì)同意且所有納入研究者均簽署知情同意書(shū)。

1.2研究方法

所有研究對(duì)象均清晨空腹采靜脈血5 ml，留取血清-20°C凍存?zhèn)溆?。采用ELISA雙抗夾心法測(cè)定三組研究對(duì)象血清 HMGB1和 TNF-α的水平，按照試劑盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)說(shuō)明書(shū)操作。血清 ESR 采用魏氏方法檢測(cè)，血清hsCRP 采用日立7600 自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，采用 SYSMEX -XT1800 全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)血常規(guī)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 活動(dòng)期、穩(wěn)定期AS患者與正常組比較WBC計(jì)數(shù)、Hb、RBC計(jì)數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；活動(dòng)期及穩(wěn)定期患者血小板計(jì)數(shù)與正常組比較均明顯升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血沉、hsCRP穩(wěn)定期較活動(dòng)期患者明顯降低，兩組患者與正常組比較升高，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BASFI、BASDAI穩(wěn)定期較活動(dòng)期患者明顯降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

表1 研究對(duì)象的一般資料

*與穩(wěn)定期AS患者比較，P<0.001；△與正常組比較，P<0.001；※與正常組比較，P<0.05

2.2 AS患者血清HMGB1的表達(dá)與正常組比較明顯升高，經(jīng)治療穩(wěn)定期患者較未治療活動(dòng)期患者血清學(xué)水平明顯降低。

所有入組AS患者血清HMGB1水平明顯高于正常對(duì)照組(W= 238.00，P<0.001，見(jiàn)表2)；初診未經(jīng)治療活動(dòng)期的AS患者HMGB1水平較正常組明顯增高(W= 96.00，P<0.001，見(jiàn)表2)；經(jīng)治療穩(wěn)定期AS患者較活動(dòng)期患者則明顯下降(W= 133.00，P<0.001，見(jiàn)表2)，但仍高于健康對(duì)照組(W=142.00，P<0.002見(jiàn)表2)。

2.3 AS患者血清TNF-α的表達(dá)與正常組比較明顯升高，且經(jīng)過(guò)治療后血清學(xué)水平明顯降低。

全部AS患者TNF-α血清水平明顯高于正常對(duì)照(t=5.080，P<0.001見(jiàn)表3)；初診未經(jīng)治療活動(dòng)期和經(jīng)治療穩(wěn)定期的AS患者TNF-α水平較正常組AS患者明顯增高(t=7.038，P<0.001；t=2.977，P<0.005見(jiàn)表2)；但經(jīng)治療穩(wěn)定期的AS患者血清TNF-α水平較未經(jīng)治療初診患者明顯下降(t=4.004，P<0.001見(jiàn)表2)。

2.4 AS患者血清HMGB1和TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.811)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性，P<0.001。AS患者血清中HMGB1和TNF-α水平與炎性指標(biāo)血沉(r=0.428，0.534)和hsCRP(r=0.515，0.519)以及軀體功能指數(shù)BASFI(r=0.521，0.568)和疾病活動(dòng)指數(shù)BASDAI(r=0.493，0.564)均呈明顯的正相關(guān)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性，P<0.001；而二者與患者的年齡、病程、白細(xì)胞、血小板均無(wú)相關(guān)性，P>0.05。

表2 強(qiáng)直性脊柱炎患者不同疾病活動(dòng)程度以及正常組血清HMGB1水平的比較，M(P25，P75)

*與正常對(duì)照組比較；#與穩(wěn)定期患者比較。

表3 強(qiáng)直性脊柱炎患者不同疾病活動(dòng)程度以及正常組血清TNF-α水平的比較，

*與正常對(duì)照組比較；#與穩(wěn)定期患者比較。

表4 強(qiáng)直性脊柱炎患者臨床特征與血清HMGB1、TNF-α水平的相關(guān)系數(shù)

**P<0.001

3 討論

高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是廣泛存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)的一種高度保守的非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，單核巨噬細(xì)胞在受到炎性刺激后，能夠主動(dòng)使位于核內(nèi)的HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿，并可通過(guò)蛋白質(zhì)非經(jīng)典分泌途徑將其分泌到細(xì)胞外[2]。另外，壞死細(xì)胞也可以被動(dòng)釋放HMGB1[5]。在細(xì)胞外，HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎因子，是啟動(dòng)和維持炎癥瀑式反應(yīng)的中心分子，介導(dǎo)多種急慢性炎癥性疾病。在HMGB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究[6,7]中發(fā)現(xiàn)，HMGB1依賴于RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活NF-κB[6,8]，使NF-κB由細(xì)胞質(zhì)移位至核內(nèi)，啟動(dòng)多種炎癥因子轉(zhuǎn)錄，從而引起多重促炎癥反應(yīng)。另外HMGB1可以通過(guò)活化Toll樣受體2(TLR-2)和Toll樣受體4(TLR-4)引起髓性分化因子88(MyS88)和IL-1受體相關(guān)的激酶(IRAK)的修復(fù)，繼而激活MAPK途經(jīng)和NF-κB的核轉(zhuǎn)位，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)產(chǎn)生[7]。可見(jiàn)，HMGB1作為一個(gè)致炎因子，在細(xì)胞因子瀑布效應(yīng)和功能前反饋機(jī)制中促使下游炎癥反應(yīng)的發(fā)生。另一方面，TNF-α的分泌，也可以促進(jìn)HMGB1的釋放,從而形成惡性循環(huán)，造成瀑布式的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使炎癥不斷的擴(kuò)大和加重，導(dǎo)致疾病發(fā)生。

AS是一種骨破壞伴新骨形成導(dǎo)致脊柱強(qiáng)直和功能損傷的慢性炎癥性疾病。近年來(lái)已證實(shí)TNF-α是許多慢性炎癥的早期致炎因子。已有大量證據(jù)表明TNF-α在AS的發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，且作為治療的靶點(diǎn)在臨床治療中已收到了很大的效果。我們的研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較HMGB-1和TNF-α在AS患者中都是高表達(dá)的。而對(duì)活動(dòng)期和穩(wěn)定期AS患者的HMGB-1和TNFα水平比較發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期二者血清水平明顯下降。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1和TNFα血清水平與炎性指標(biāo)ESR和hsCRP以及疾病活動(dòng)指數(shù)BASDAI和功能指數(shù)BASFI呈明顯的正相關(guān)，因此，我們可以推斷HMGB-1可能參與了AS的致病過(guò)程，且表達(dá)水平與疾病活動(dòng)相關(guān)。

HMGB1對(duì)TNF-α表達(dá)水平影響的分子作用機(jī)制的探討中發(fā)現(xiàn)HMGB1對(duì)TNF-α合成具有直接調(diào)節(jié)效應(yīng)[9]； HMGB1可刺激人單核/巨噬細(xì)胞系分泌大量的細(xì)胞因子TNF-α，且TNF-α的釋放與HMGB1刺激濃度間有顯著的劑量依賴性關(guān)系，并且HMGB1刺激TNF-α合成的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)具有延遲性和反應(yīng)雙相性[10]，這一特點(diǎn)對(duì)于炎癥反應(yīng)的維持和延長(zhǎng)具有重要作用。本研究對(duì)AS患者血清HMGB-1和TNF-α水平相關(guān)分析顯示，二者呈明顯的正相關(guān)，由此提示AS的活動(dòng)期，增高的HMGB1可能通過(guò)激活NF-κB的核轉(zhuǎn)位，引起TNF-α的大量釋放，從而導(dǎo)致了關(guān)節(jié)炎癥的加重。HMGB1作為一種刺激TNF-α釋放的前炎癥因子，是否可以通過(guò)抗HMGB1治療，抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減少TNF-α的釋放，從而減輕AS疾病的嚴(yán)重程度，為AS的治療提供新的途徑。

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