許 茵，楊小娟，蒯守剛

(無錫市第五人民醫(yī)院 檢驗科，江蘇 無錫214007)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是好發(fā)于中年女性的慢性自身免疫性疾病[1]。在環(huán)境和遺傳因素的聯(lián)合作用下，患者免疫系統(tǒng)固有的特定調(diào)控機制被破壞，產(chǎn)生了針對肝臟的自身免疫反應[2]。而Th細胞在介導自身抗體的產(chǎn)生以及膽管內(nèi)皮細胞的免疫功能方面發(fā)揮舉足輕重的作用[3]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是一種新型的免疫抑制細胞，對自身抗原和外來抗原引起的免疫反應均有重要的調(diào)節(jié)作用，但其免疫機制目前尚未完全清楚[4]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞免疫負性調(diào)節(jié)作用使細胞免疫應答能力下降，最終導致疾病不斷進展甚至惡化。本文采用流式細胞儀檢測了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血中CD4+CD25+T細胞相關(guān)參數(shù)，旨在為探討CD4+CD25+T細胞是否參與PBC患者細胞免疫應答提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1研究對象2011年02月至2012年04月無錫市第五人民醫(yī)院住院和門診的PBC患者32例，診斷符合2000年美國肝病學會PBC診斷標準[5]，32例患者中男性3例，女性患者29例，平均年齡53.6±7.2歲?；颊吲懦渌《拘愿尾?，無輸血、酗酒、服用損傷肝臟藥物史。收集23例健康體檢者作為對照組，男3例，女20例，平均年齡50.3±6.7歲。

1.2試劑肝功能生化試劑由日本和光純藥工業(yè)提供，生化儀為奧林帕斯5400。 流式細胞儀檢測調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的熒光標記抗體CD4-FITC抗體、CD25-PECy5抗體和Foxp3-PE抗體均購自美國BD公司；提取細胞總RNA的Trizol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；自身抗體檢測試劑為歐蒙醫(yī)學診斷公司產(chǎn)品，方法為免疫印跡法；流式細胞儀：美國Beckman Coulter 3XL。PCR儀器為美國ABI-7300，瓊脂糖凝膠由北京天來公司提供。

1.3流式細胞儀檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞亞群制備外周血單個核細胞(PBMC)懸液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，阻斷非特異染色后加入CD4-FITC抗體和CD25-PECy5抗體各20 μl,4℃避光孵育30 min,然后進行細胞內(nèi)Foxp3分子的熒光抗體染色；預冷的PBS洗滌細胞離心后加入1 ml新鮮配制的固定穿孔工作液，振蕩混勻，4℃避光孵育30-60 min；孵育后加入2 ml預配好的穿孔液避光孵育，正常血清封閉后，加入20 μl PE標記的抗人Foxp3熒光抗體,4℃避光孵育30 min,孵育結(jié)束后洗滌離心，用PBS重懸細胞沉淀上機檢測。

1.4Foxp3mRNA表達的檢測實時熒光定量PCR檢測外周血CD4+T細胞中Foxp3mRNA基因的表達。將研究對象的抗凝靜脈血分離外周血單個核細胞，采用細胞裂解方法提取外周血總RNA;用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，并用紫外分光光度儀測定其濃度；按照cDNA反應試劑盒說明書合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參照擴增的目的基因，PCR反應參數(shù)95℃5 min變性，95℃45 s，56℃1 min，72℃1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂凝膠電泳，由成像分析系統(tǒng)攝片測定其分光光度計算FOXP3mRNA的表達水平。FOXP3mRNA表達量=目的基因面積分管密度值/β-actin面積積分分光密度值。

1.5統(tǒng)計學分析所有資料均輸入SPSS12.0軟件包，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 32例PBC患者肝組織均存在界板炎性反應，43.75%(14/32)的患者存在肝細胞淤膽；53.13%(17/32)的患者存在匯管區(qū)纖維組織增生，假小葉生成；32例患者臨床癥狀包括乏力59.38%(19/32)；皮膚瘙癢31.25%(10/32)；肝區(qū)不適43.75%(14/32)以及食欲不振，肌肉疼痛等。體征包括黃疸56.25%(18/32)，肝、脾腫大46.88%(15/32)和43.75%(14/32)。

2.2 自身抗體與肝功能檢測結(jié)果見表1、2。

表1 32例PBC患者自身抗體檢測結(jié)果

2.3 PBC患者外周血CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義；Foxp3的mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義。

表2 PBC患者與健康對照組肝功能檢測結(jié)果

表3 外周血調(diào)節(jié)性T細胞表達比較

2.4 PBC組與健康對照組比較外周血CD4+T細胞中Foxp3 mRNA的含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

PBC是一種免疫介導的肝臟損傷性疾病，多數(shù)患者有不同程度的肝功能異常，病理表現(xiàn)為肝內(nèi)小膽管慢性進行性非化膿性炎性損傷為特征，導致逐漸進展為膽管阻塞膽汁淤積，引起肝纖維化，肝硬化并最終導致肝功能衰竭為特征的進行性破壞性肝病[6]。PBC常見于女性，多數(shù)患者存在高效價的自身抗體如ANA，LKM等。AMA/AMA-M2陽性是診斷PBC的重要依據(jù)(93.75%)。抗核包膜蛋白GP210和抗核點蛋白SP100對PBC有高度特異性，在AMA/AMA-M2 陰性患者中通過肝穿刺病理檢測后確診[7]。

以往研究表明，Th細胞在PBC的發(fā)病機制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8-9]，而調(diào)節(jié)性T淋巴細胞功能缺失是打破機體免疫耐受的關(guān)鍵因素[10]，CD4+CD25+Foxp3+T細胞是其主要的T淋巴細胞亞群，占外周血CD4+T淋巴細胞的5%-10%，它們表達的表面標志分子包括糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4和叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子p3(Foxp3)，能抑制自身免疫性T淋巴細胞的增殖和功能，其中Foxp3是人調(diào)節(jié)性T淋巴細胞特異性的表面標志分子與調(diào)節(jié)性T淋巴細胞抑制功能密切相關(guān)[11]。我們對PBC患者體內(nèi)Foxp3的mRNA水平進行分析，并未發(fā)現(xiàn)PBC組與健康對照組之間存在差異，因此我們認為在mRNA水平上不支持Foxp3的表達異常導致了PBC的耐受缺失，Lan等對PBC中調(diào)節(jié)性T細胞功能研究也并未發(fā)現(xiàn)這些細胞有功能缺陷，這些結(jié)果并不支持PBC患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞產(chǎn)生減少或者是凋亡增加抑或存在功能缺陷。本實驗數(shù)據(jù)結(jié)果與國內(nèi)外同類報道觀點接近，證實PBC患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞低于健康對照組。PBC患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達低下或絕對量缺乏抑制自身反應性T淋巴細胞的增生，可能是PBC發(fā)病以及病情加重的因素之一。由此針對其免疫發(fā)病機制的調(diào)節(jié)性T淋巴細胞過繼治療逐步發(fā)展，通過體外培養(yǎng)增殖調(diào)節(jié)性T淋巴細胞細胞，回輸至患者發(fā)揮免疫抑制作用[12]，糾正患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的相對平衡，將有望成為治療的新途經(jīng)。

作者簡介：許菌，42歲，女，本科，主管技師，主要研究方向：生化、免疫。

參考文獻：

[1]Kaplan MM,Gershwin ME.Primary biliary cirrhosis[J].N Engl J Med,2005,353:1261.

[2]Lleo A,Invernizzi P,Mackay IR,et al.Etiopathogenesis of primary biliary cirrhosis[J].World J Gastroenterol,2008,14:3328.

[3]Invernizzi P,Selmi C,Gershwin ME,et al.Update on primary biliary cirrhosis[J].Dig Liver Dis,2010,42:401.

[4]Joshi A,Vahlenkamp TW,Garg H,et al.Preferential replication of FTV in activated CD4+CD25+T cells independent of cellular proliferation[J].Virology,2004,321:307.

[5]Heathcote EJ.Management of primary biliary cirrhosis.The american association for the study of liver diseaes practice guidelines[J].Hepatology,2000,31:1005.

[6]Kouroumalis E,Notas G.Pathogenesis of prim ary b iliary cirrhosis:a unifying model[J]．World J Gastroenterol,2006,12:2320．

[7]張 波,裴 豪，原發(fā)性膽汁性肝硬化患者臨床及外周CD4+CD25+T細胞變化的研究[J]．肝臟，2010，15：31．

[8]Rong G,Zhou Y,Xiong Y,et al.Imbalance between T helper type 17 and T regulatory cells in patients with primary biliary cirrhosis:the serum cytokine profile and peripheral cell population[J].Clin Exp Immunol,2009,156:217.

[9]Harada K,Shimoda S,Sato Y,et al.Periductal interleukin-17 production in association with biliary cirrhosis[J].Clin Exp Immunol,2009,157:261.

[10]Longhi MS,Hussain MJ,Mitry RR,et al.Functional study of CD4+CD25+regulatory T cells in health and autoimmune hepatitis[J].J Immunol,2006,176:4484.

[11]李海文,張 政,等．自身免疫性肝炎的免疫性致病機制和免疫干預研究進展[J]．中華肝臟病雜志，2010,18：958．

[12]Longhi MS,Meda F,Wang P,et al.Expansion and de novo generation of potentially therapeutic regulatory T cells in patients with autoimmune hepatitis[J].Hepatology,2008,47:581.