王嘉慧，李 濤，李承晏，高文蔚

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 1.放射科；2.神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢430060)

神經(jīng)調(diào)控是一個新興的快速發(fā)展的多學(xué)科交叉領(lǐng)域，涵蓋醫(yī)學(xué)、物理學(xué)和生物工程學(xué)，利用植入性和非植入性技術(shù)，依靠電或化學(xué)手段調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能治療疾病、改善患者生活質(zhì)量。皮層電刺激是通過神經(jīng)調(diào)控、促進(jìn)卒中后神經(jīng)功能康復(fù)的一種新的治療腦卒中方法[1-3]。微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)是一種微管蛋白調(diào)節(jié)因子，主要存在于神經(jīng)元的樹突、胞體和樹突棘中，MAP-2的丟失是神經(jīng)功能障礙的誘因。為了探究皮層電刺激治療腦卒中的原理，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用皮層電刺激治療缺血性腦卒中模型大鼠，觀察電刺激對大鼠梗死灶周圍及對側(cè)皮層微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

Biospec4.7/30超導(dǎo)磁共振成像儀(中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所，波譜與原子分子物理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；珊頓石蠟切片機(jī)(英國)；小鼠抗大鼠MAP-2 IgG (武漢博士德生物工程有限工程)；山羊血清(武漢博士德生物工程有限工程)；羊抗小鼠FITC熒光二抗(美國Jakson公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物選擇和分組 健康成年SPF級雄性SD大鼠共105只，體重250 g左右。采用線栓法制作大腦中動脈阻塞模型后，選擇Bederson評分為1-4分的大鼠進(jìn)行MRI，篩選24只皮層梗死大鼠，隨機(jī)分為電刺激組(cortical electrical stimulation,CES)13只和非刺激組(no stimulation，NS)11只。

1.2.2 刺激器植入術(shù)和電刺激治療 兩組大鼠均植入刺激器，刺激器為單級刺激模式，包括一個刺激電極、一對電極和一個脈沖發(fā)送器。于造模成功后1周植入。具體方法為：刺激器用環(huán)氧乙烷滅菌，模型鼠術(shù)前紫外線照射2 h后進(jìn)行腹腔麻醉，取俯臥位固定于立體定位儀上，正中切口切開頭皮以暴露顱骨，于近梗死灶邊緣部位植入電極并標(biāo)記。鉆開顱骨至硬膜，將孔擴(kuò)至1.5 mm左右，挑開硬膜，將刺激電極植入硬膜下梗死邊緣皮質(zhì)表面。電極的硅膠片用生物膠黏合固定在顱骨表面并密封，分離頸背部皮下組織，將脈沖發(fā)生器植入皮下，其中將電極與皮下組織表面貼附。非刺激組不施加電刺激治療，刺激組增加電刺激治療，具體為：刺激器每天8：00-8：30和20：00-20：30開啟，電流為0.65 mA。刺激脈沖是由50，20，5Hz組成的循環(huán)脈串，10s一個周期，脈沖寬200μs，電刺激治療持續(xù)2周后停止。

1.2.3 標(biāo)本制備 從刺激器植入時開始，6周后取腦組織放入多聚甲醛固定，24 h后進(jìn)行冠狀位石蠟包埋連續(xù)切片，片厚4 μm，對切片進(jìn)行連續(xù)編號，每個組織在所有腦切片等間隔挑選10張腦片進(jìn)行染色分析。

1.2.4 微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)免疫熒光染色 切片烤片，脫蠟，水化后PBS沖洗3次；抗原修復(fù)(微波修復(fù)法)，室溫冷卻1 h后再PBS沖洗3次，5%山羊血清封閉20 min，滴加小鼠抗大鼠MAP-2一抗，4 ℃過夜后，37 ℃水浴箱復(fù)溫，PBS洗片3次，避光加羊抗小鼠FITC熒光二抗后，37 ℃孵育1.5 h，PBS洗片3次，避光封片。

1.2.5 圖像分析 每張切片隨機(jī)選取梗死灶周圍及對側(cè)相應(yīng)皮層各5個視野進(jìn)行照像(光學(xué)顯微鏡，400倍)，用Image-Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定梗死周邊區(qū)及與梗死灶對側(cè)相應(yīng)皮層MAP-2免疫染色陽性細(xì)胞所占的單位面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 植入式皮層電刺激對缺血性腦卒中大鼠梗死周圍區(qū)MAP-2表達(dá)水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)，電刺激組大鼠梗死周圍區(qū)MAP-2表達(dá)呈代償性的增多，而非刺激組大鼠MAP-2表達(dá)稀少。兩組大鼠梗死周圍區(qū)MAP-2表達(dá)水平差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.189,P<0.01)。見圖1，圖2。

A為CES組，B為BNS組(SP，×400，標(biāo)尺：100 μm)

與NS組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 植入式皮層電刺激對腦梗死大鼠梗死對側(cè)半球皮層中MAP-2表達(dá)水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)，與非刺激組相比，電刺激組大鼠梗死對側(cè)半球相應(yīng)皮層中MAP-2表達(dá)增加。兩組大鼠梗死對側(cè)半球MAP-2表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.454,P<0.05)，見圖2、圖3。

A為CES組，B為BNS組(SP，×400，標(biāo)尺：100 μm)

3 討論

皮層電刺激是卒中后神經(jīng)功能康復(fù)的一種新的治療腦卒中的方法，其機(jī)制尚不清楚。自2003年至今，一些動物實(shí)驗(yàn)和Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗(yàn)均成功地報道了皮層電刺激作為輔助性治療措施，結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療腦卒中后運(yùn)動功能障礙的安全性和有效性，使得皮層電刺激可能成為促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)功能康復(fù)的新方法[2-6]。Adkins等[2]將電極植入皮質(zhì)硬膜外，對康復(fù)治療聯(lián)合皮層電刺激10天后的行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，50 Hz刺激頻率相比250 Hz刺激頻率具有更好治療效果，且能增加微管相關(guān)蛋白-2的表達(dá)水平。Adkins等[3]則利用100 Hz頻率電刺激聯(lián)合康復(fù)治療18天，得出了類似的結(jié)果，同時電刺激可增加病灶周圍神經(jīng)元和突觸密度，促進(jìn)突觸結(jié)構(gòu)可塑性。Kleim等[4]和Teskey等[6]分別用不同刺激參數(shù)進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)，均發(fā)現(xiàn)頻率為50-100Hz、強(qiáng)度為域值40%-70%的電刺激能夠顯著提高卒中大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)。

以往的皮層電刺激治療缺血性腦卒中大鼠實(shí)驗(yàn)多采用單一頻率脈沖串。本課題組前期采用50、20、5 Hz變頻脈沖串治療缺血性腦卒中大鼠16天，可促進(jìn)卒中后大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)，增加病灶周圍微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)，其可能的機(jī)制是：電流達(dá)到皮質(zhì)組織后可以維持和調(diào)節(jié)腦梗死邊緣區(qū)神經(jīng)組織的興奮性，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[7]，而變頻脈沖串則可能激活不同部位、不同類型的神經(jīng)元，達(dá)到輔助康復(fù)治療的效果[8]。

突觸結(jié)構(gòu)的可塑性是突觸可塑性重要的組成部分，其形態(tài)變化的內(nèi)在機(jī)制是突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變。微管相關(guān)蛋白-2屬于結(jié)構(gòu)性微管相關(guān)蛋白家族，是調(diào)節(jié)微管蛋白組裝及動力學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子。微管相關(guān)蛋白-2在維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、細(xì)胞分化及調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能可塑性中發(fā)揮重要作用[9]。微管相關(guān)蛋白-2丟失可產(chǎn)生神經(jīng)元形態(tài)和功能的改變。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)缺血中心區(qū)微管相關(guān)蛋白-2免疫反應(yīng)消失，而長時間再灌注的缺血半暗帶區(qū)微管相關(guān)蛋白-2出現(xiàn)選擇性的增高，表明病灶周圍突觸結(jié)構(gòu)重建，可能是一種短暫性局灶性腦缺血的補(bǔ)償與修復(fù)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上，將觀察時間延長至電刺激治療結(jié)束后4周。結(jié)果顯示，微管相關(guān)蛋白-2在電刺激組大鼠梗死灶周圍及對側(cè)皮層表達(dá)均要高于非刺激組，表明皮層電刺激可以增加梗死灶周圍及梗死對側(cè)皮層神經(jīng)元軸突密度，從而誘導(dǎo)雙側(cè)皮層神經(jīng)元軸突的可塑性改變，而且這種改變在電刺激治療結(jié)束后仍然持續(xù)存在。另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)電刺激組與非刺激組大鼠梗死灶周圍微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)較前期實(shí)驗(yàn)差異更顯著，推測隨著時間的延長皮層電刺激誘導(dǎo)神經(jīng)可塑性改變更明顯。然而，對于皮層電刺激會對梗死側(cè)和梗死對側(cè)神經(jīng)元軸突的可塑性均會產(chǎn)生影響的機(jī)制尚待研究。Andres等[11]用干細(xì)胞移植治療腦梗死時發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植可使雙側(cè)皮質(zhì)軸突明顯增加，認(rèn)為雙側(cè)皮層軸突的可塑性改變與損傷側(cè)殘存腦組織及對側(cè)腦組織間的神經(jīng)纖維連接回路有關(guān)。因此，我們推測皮層電刺激促進(jìn)雙側(cè)皮層的可塑性改變可能與電刺激活化大腦皮質(zhì)間的神經(jīng)纖維聯(lián)系通路有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用皮層電刺激而不聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練對動物腦梗死后肢體功能的恢復(fù)亦是有效的。運(yùn)用全植入式皮層電刺激器可以增加梗死灶周圍和對側(cè)皮層微管相關(guān)蛋白-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)雙側(cè)皮層神經(jīng)元軸突的可塑性改變，并且這種改變在皮層電刺激結(jié)束后仍然存在，皮層電刺激可能通過誘導(dǎo)雙側(cè)神經(jīng)元軸突的可塑性來改善腦卒中后運(yùn)動功能的恢復(fù)。

作者簡介：王嘉慧(1987-)，女，碩士研究生，住院醫(yī)師，主要從事神經(jīng)病學(xué)和放射學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用研究。

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