李光燮，王 師，王 丹，李英順，金清華*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)教研部，吉林 延吉133002；2.延邊大學(xué)臨床學(xué)院)

海馬是哺乳類動(dòng)物完成學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[1]，海馬的三個(gè)亞區(qū)及其相關(guān)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在各種學(xué)習(xí)記憶中起著不同的作用[2]：①齒狀回(DG)區(qū)在傳入信息的編碼中有重要作用；②CA3區(qū)在工作記憶和短時(shí)程記憶的鞏固和再現(xiàn)中起關(guān)鍵作用；③CA1區(qū)對(duì)中時(shí)程記憶的鞏固和再現(xiàn)很重要。文獻(xiàn)報(bào)道，損毀大鼠海馬DG區(qū)可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能的損害[3，4]，提示海馬DG區(qū)作為信息進(jìn)入海馬的傳入點(diǎn)，對(duì)信息進(jìn)行處理和編碼，在學(xué)習(xí)記憶中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，海馬內(nèi)氨基酸類物質(zhì)的改變可影響學(xué)習(xí)記憶能力[5]，我們先前的研究也表明，海馬DG區(qū)內(nèi)的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)和?；撬?Tau)的含量在回避性條件反射建立過程中明顯增加[6]。

黃芪(Radix Astragali)系多年生草本植物，又叫北芪、綿芪等，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，其成分主要有多糖、黃酮類和皂苷類等[7]。黃芪作為一味常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效。研究表明，黃芪還具有抗疲勞、抗病毒感染、調(diào)節(jié)血糖、抗腦缺血缺氧、抗氧化、增加機(jī)體免疫力、提高記憶力等諸多功效[8]。雖然黃芪因其抗氧化、抗腦缺血缺氧等作用在增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的研究上備受關(guān)注，但是到目前為止，關(guān)于黃芪對(duì)海馬區(qū)氨基酸類物質(zhì)的釋放是否有影響未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)利用穿梭箱觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的基礎(chǔ)上，主要利用腦部微量透析法和高效液相色譜法觀察了黃芪水體液對(duì)海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的氨基酸類物質(zhì)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性Wistar大鼠24只，體重為200±20 g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。動(dòng)物隨機(jī)分成3個(gè)組，即對(duì)照組、黃芪小劑量組(1.5g/kg)、黃芪大劑量組(4.5g/kg)，每組各8只。

1.2 黃芪水提取物的制備及灌胃

長白山道地黃芪，4-5年生。先將藥材浸泡24小時(shí)，然后煎煮3次，每次加入10倍黃芪量的水，每次煎煮120 min，將3次濾液混勻，濃縮制得浸膏，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，用生理鹽水稀釋浸膏，制備0.6 g/ml和1.8 g/ml的黃芪水體液，分別用在黃芪小劑量和大劑量組。采用無損傷灌胃針每次灌胃0.5 ml相應(yīng)溶液(對(duì)照組用生理鹽水)，每日1次，持續(xù)3周。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 手術(shù)及DG區(qū)微量透析過程 大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)進(jìn)行腹腔麻醉，腹臥位固定于立體腦定位儀上，參照Paxinos和Watson大鼠腦圖譜，將透析用外套管(內(nèi)徑 0.50 mm,外徑0.70 mm)插入到DG上1 mm處(前囟向后3.4 mm,正中線旁開2.2 mm,深度 2.5 mm),并用牙托粉固定于顱骨表面。經(jīng)透析用外套管將自制的微量透析探針垂直插入到DG區(qū)，并用蠟固定。探針超出套管1.0 mm，其前端有外徑0.2 mm的乙酸纖維素半透膜(DM-22，Eicom,日本)，可濾過分子量小于50000的物質(zhì)。微量透析探針連接于微量泵(ESP-64，日本Eicom公司),以1.5 μl/ min的速度灌流改良Ringer’s液(147 mM NaCl，4 mM KCl，2.3 mM CaCl2，pH 6.5),穩(wěn)定60 min后,經(jīng)自動(dòng)收集器(EAS-20，Eicom，日本)收集微量透析樣本,每管樣本收集10 min,每只動(dòng)物收集3個(gè)管,取平均值。樣本收集結(jié)束后，拔出探針，外套管封好，大鼠回籠恢復(fù)。術(shù)后第二天開始灌胃，持續(xù)3 w。灌胃結(jié)束后，大鼠水合氯醛麻醉，經(jīng)外套管將微量透析探針重新插入到DG區(qū)，收集海馬DG區(qū)微量透析樣本(方法同上)，然后進(jìn)行穿梭箱訓(xùn)練。

1.3.2 微量透析樣本中的6種氨基酸含量的測定 每管樣本取12 μl和3 μl的OPA溶液在室溫下反應(yīng)2.5 min后,抽取10 μl注入到生物活性物質(zhì)微量分析系統(tǒng) (HTEC-300，日本Eicom公司),以0.5 μl/min的速度流過高效液相色譜分離柱和電化學(xué)檢測器分析出氨基酸類物質(zhì)的濃度,包括天冬氨酸(Aspartate,Asp)、谷氨酸(glutamate,Glu)、谷氨酰胺(glutamine,Gln)、甘氨酸(glycine,Gly)、牛磺酸(taurine,Tau) 和丙氨酸(Alanine,Ala)(圖1)。

圖1 海馬DG區(qū)6種氨基酸的典型高效液相色譜圖

1.3.3 行為學(xué)檢測 穿梭箱是一長方體箱子，中間用一隔板分開，隔板底部中間有一個(gè)半圓型洞，使兩個(gè)隔間相通，動(dòng)物可通過此洞在兩隔間自由穿梭。每天的穿梭訓(xùn)練過程如下：將大鼠置于其中一個(gè)間隔，適應(yīng)3 min，先給5 s聲音刺激，再給10 s電刺激(如果動(dòng)物穿過洞口，達(dá)到另一隔間，就結(jié)束該次聲音或電刺激)，間隔20 s，重復(fù)相同刺激，共20次。每天進(jìn)行一次穿梭訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練5天。每天完成20次訓(xùn)練所需要的時(shí)間作為大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

1.4 組織學(xué)鑒定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物過量麻醉處死，取腦固定在10%的福爾馬林溶液中，3天后進(jìn)行冠狀面的冰凍切片(厚度約60 μm)、中性紅染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)鑒定，確定透析探針的位置是否在DG區(qū)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)鑒定

大鼠腦標(biāo)本與Paxinos & Waston大鼠腦圖譜進(jìn)行對(duì)比，確認(rèn)微量透析探針的位置(圖2)，透析探針未進(jìn)入海馬DG區(qū)者不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

2.2 黃芪水提取液對(duì)大鼠海馬DG區(qū)氨基酸類物質(zhì)含量的影響

圖2 標(biāo)記微量析透析探針在DG區(qū)位置的典型顯微組織圖

大鼠在灌胃開始之前測定海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly、Tau和Ala含量，結(jié)果顯示，每種氨基酸含量在各組之間沒有顯著性差異(均為P>0.05，表1，2)。對(duì)照組利用生理鹽水灌胃3w，灌胃前后DG區(qū)細(xì)胞外液中的6種氨基酸含量沒有顯著的變化(均為P>0.05，表1，2)。黃芪小劑量組和黃芪大劑量組利用黃芪水提液灌胃3w，灌胃前后海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly和Ala的含量沒有出現(xiàn)明顯的變化(均為P>0.05，表1，2)。

黃芪小劑量組大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中Tau的含量，給藥前為0.84±0.05 μmol/L，而灌胃后為0.99±0.06 μmol/L，兩者有顯著性差異(P<0.05，表1)。黃芪大劑量組海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中Tau的含量，灌胃前為0.80±0.08 μmol/L，而黃芪水提液灌胃后為0.98±0.09 μmol/L，灌胃前后比較有顯著性差異(P<0.05，表1)。對(duì)照組大鼠生理鹽水灌胃前后，海馬DG區(qū)的Tau含量無明顯變化(P>0.05，表1)。利用黃芪水提液灌胃3w后，大鼠DG區(qū)細(xì)胞外液中的Tau含量明顯增加，和對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05，圖3)。

表1 黃芪對(duì)大鼠海馬DG區(qū)Asp、Glu、Gln含量的影響 (μmol/L)

表2 黃芪對(duì)大鼠海馬DG區(qū)Gly、Tau、Ala含量的影響 (μmol/L)

*P<0.05，與灌胃前比較

圖3 黃芪水提液對(duì)海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的

以大鼠灌胃前的Tau含量作為100%，計(jì)算出灌胃后的Tau含量百分比。 #P<0.05，與對(duì)照組相比。

2.3 黃芪水提取液對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

灌胃3w后，大鼠每天完成20次的穿梭訓(xùn)練,連續(xù)訓(xùn)練5天。對(duì)照組在整個(gè)訓(xùn)練期間，每天訓(xùn)練所需時(shí)間無明顯變化(P>0.05)；黃芪小、大劑量組的每天訓(xùn)練所需時(shí)間逐漸縮短，到第四、第五天，訓(xùn)練所需時(shí)間與第一天比較有顯著性差異(均為P<0.05)，與同一天的對(duì)照組相比，也有顯著性差異(均為PP<0.05)(圖4)。

3 討論

黃芪是一味常用中藥，其成分主要有多糖、黃酮類和皂苷類等，而且還含有硒、鋅、鐵等14種微量元素[7]。研究表明，黃芪可通過抑制鈉泵活性、減少能量代謝障礙、清除氧自由基等途徑促進(jìn)腦血管再生、減少腦細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善腦缺血缺氧損傷后的學(xué)習(xí)記憶能力[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，用黃芪水提液灌胃的大鼠在穿梭訓(xùn)練過程中出現(xiàn)訓(xùn)練所需時(shí)間的明顯縮短，提示黃芪可以提高其回避反應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶能力。雖然這些都提示黃芪可提高學(xué)習(xí)記憶能力，但黃芪對(duì)海馬區(qū)氨基酸類物質(zhì)的影響報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了黃芪對(duì)海馬DG區(qū)氨基酸類物質(zhì)含量的影響。

圖4 黃芪水提液對(duì)穿梭訓(xùn)練中的每天訓(xùn)練所需

學(xué)習(xí)和記憶屬于腦的高級(jí)功能，學(xué)習(xí)指人或動(dòng)物從外界環(huán)境獲取新信息的過程，記憶是指大腦將獲得的信息進(jìn)行編碼、貯存和提取的過程，二者密不可分。眾所周知，海馬是哺乳類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，研究表明，海馬內(nèi)的氨基酸類物質(zhì)參與學(xué)習(xí)記憶功能[5]，而且腦缺血常伴有氨基酸類物質(zhì)的增加[10]。海馬DG區(qū)在新信息的處理和編碼中起著至關(guān)重要的作用[2]，而我們先前的研究證明，在大鼠回避反應(yīng)學(xué)習(xí)過程中伴有海馬DG區(qū)內(nèi)氨基酸類物質(zhì)的增加[6]。為了進(jìn)一步探討黃芪對(duì)學(xué)習(xí)記憶的改善作用是否與海馬內(nèi)的氨基酸類物質(zhì)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)利用腦部微量透析法和高效液相色譜法測定了海馬DG區(qū)細(xì)胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly、Tau和Ala的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪可明顯增加大鼠海馬DG區(qū)Tau含量。

Tau是一種結(jié)構(gòu)簡單的β-氨基酸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布在大腦皮質(zhì)、海馬、小腦等區(qū)域，可能作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)起作用。文獻(xiàn)報(bào)道，Tau可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力、對(duì)缺血和驚厥等引起的神經(jīng)元損害具有對(duì)抗作用，而且Tau與Glu關(guān)系密切，在大腦中二者水平呈高度正相關(guān)，Tau可通過抑制Glu的活性來減輕Glu的神經(jīng)毒性作用[11，12]。另外，Tau能增加海馬和皮層內(nèi)Fos蛋白、B-EP，AVP的含量，這與學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)節(jié)有關(guān)[13]。因此，我們推測黃芪改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與海馬DG區(qū)Tau含量增加有關(guān)，但其下游的機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

作者簡介：李光燮(1973-)，男， 博士研究生，研究方向?yàn)樯窠?jīng)生理學(xué)。金清華(1971-)，女，博士學(xué)位，教授，博士生導(dǎo)師, 研究方向?yàn)樯窠?jīng)生理學(xué)。

參考文獻(xiàn)：

[1]L Squire.Memory and the hippocampus:A synthesis from findings with rats,monkeys,and humans[J].Psychological Review,1999,2:195.

[2]RP Kesner,I Lee,P Gilbert.A behavioral assessment of hippocampal function based on a subregional analysis[J].Rev Neurosci,2004,15:333.

[3]H Jeltsch,F Bertrand,C Lazarus,et al.Cognitive performances and locomotor activity following dentate granule cell damage in rats:role of lesion extent and type of memory tested[J].Neurobiol Learn Mem,2001,76:81.

[4]GF Xavier,FJB.Oliveira-Filho,AMG.Santos.Dentate gyrus-selective colchicine lesion and disruption of performance in spatial tasks:difficulties in “place strategy” because of a lack of flexibility in the use of environmental cues[J].Hippocampus,1999,9:668.

[5]李永生，閻學(xué)案.中樞神經(jīng)遞質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志，2006，23(7):864.

[6]劉巧鳳，金清華，姜海英，等.習(xí)得性長時(shí)程增強(qiáng)中清醒大鼠海馬齒狀回幾種氨基酸的變化[J]．中國臨床康復(fù)，2006，10(38)：71.

[7]LW Qi,QT Yu,P Li,et al.Quality evaluation of Radix Astragali through asimultaneous determination of six major active is of lavonoids and four main saponins by high-performance liquid chromatography coupled with diode array and evaporative light scattering detectors[J].Journal of Chromatography,2006,1134:162.

[8]馬宏秀,張治祥.黃芪的藥理研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,5(27):73.

[9]蔣 犁，賈瑞酷，喬立興，等.黃芪對(duì)新生鼠乏氧缺血腦損傷后海馬區(qū)神經(jīng)的保護(hù)及學(xué)習(xí)記憶能力的干預(yù)[J].中國臨床康復(fù)，2006，10(7)：154.

[10]C Kohlhauser,S Kaehler,W Mosgoeller,et al.Histological changes and neurotransmitter leveles three months following perinatal asphyxia in the rat[J].Life Sci,1999,64:2109.

[11]A Shuaib.The role of taurine in cerebral ischemia：studies in transient forebrain ischemia and embolic focal ischemia in rodents[J].Adv Exp Med Biol，2003，526：421．

[12]張文革，王 勇，仲崇斌.?；撬釋?duì)學(xué)習(xí)記憶影響的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志，2004，21(1)：3.

[13]魏林郁，王寶英，李 炳．牛磺酸對(duì)睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24(19)：2866.