王一鳴,程 也,付丹陽,王勇濤,王姣琦,梅春麗, 莽 靖*,徐忠信*

(1.吉林大學白求恩醫(yī)學部臨床醫(yī)學院，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033 )

激活素A(ActivinA,Act A)是轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一，其作為 ActA/Smads信號通路的第一信使，通過觸發(fā)下游細胞內Smads級聯(lián)反應，完成具有一定生物學功能的信號轉導過程[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)ActA/Smads通路具有抗缺血損傷的神經(jīng)保護作用[2，3]。但其相關信號轉導及調節(jié)機制尚需進一步研究，本研究以該通路中重要的細胞內調節(jié)因子Smad7為靶點，利用RNA干擾技術抑制Smad7基因表達，檢測其對PC12細胞OGD損傷及ActA/Smads通路活化水平的影響，探討Smad7對ActA/Smads通路的調控機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞系購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫。兔抗大鼠ActA、Smad7、β-actin抗體購自Santa公司，羊抗兔二抗購自鼎國公司，鼠神經(jīng)生長因子(NGF)購自Sigma公司，Trizol 總RNA提取試劑盒購自上海生工公司，Quantscript cDNA合成試劑盒、Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒購自天根公司。Smad7和內參GAPDH基因引物委托上海生工合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng)及神經(jīng)元轉化含10%馬血清及15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)PC12細胞，2-3天換液后，當細胞接近80%融合時，胰酶消化傳代。細胞貼壁后加入終濃度為50 ng/ml 的NGF，連續(xù)刺激7天以誘導細胞神經(jīng)元樣轉化[4]。

1.2.2 氧糖剝奪模型的建立 神經(jīng)元樣PC12細胞經(jīng)含有10%胎牛血清和1.0 mol/L Na2S2O4的無糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)16 h，建立OGD16 h組[4]。

1.2.3 大鼠Smad7基因的siRNA合成 設計大鼠Smad7基因的siRNA，正義鏈5’-aacgaucugcg cucguccggcgudtdt-3’；反義鏈3’-dtdtuugcuagacgcgagcaggccgca-5’。 SiRNA及陰性對照基因序列委托吉凱生物有限公司合成。

1.2.4 siRNA轉染及分組 24孔板內細胞80%融合時行轉染，于前一天將培養(yǎng)液更換為不含血清及抗生素的高糖DMEM，分別轉染靶向Smad7基因的siRNA，陰性siRNA及對照PBS，建立陽性轉染組，陰性轉染組及空轉染組，轉染濃度50 nM，24 h后行OGD16 h。

1.2.5 Smad7基因mRNA的表達檢測 收集細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA。應用ABI7500Fast 型實時熒光定量PCR儀對Smad7基因及內參GAPDH mRNA的表達進行檢測。引物序列如下：Smad7 上游 5'-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3'，下游5'-AGT AAGGAGGAGGGGGAGAC-3'，片段大?。?04 bp；GAPDH上游5'-GGT TACCAGGGCTGCCTTCT-3'，下游5'-ATGGGTTTCCCGTTGATGAC-3'，片段大?。?71bp。結果應用Relative Quantification (ddCt) Study軟件行相對定量分析。檢測實驗重復三次。

1.2.6 MTT細胞存活率檢測 三組細胞以1×104個/孔接種于96孔板，每組10個復孔，各組隨機選擇5個復孔行OGD16 h，每孔加人20 μl的MTT(5 mg/ml)37℃孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加入200 μl的二甲基亞砜溶解藍紫色結晶，充分振蕩溶解，應用酶標儀在490 nm激發(fā)波長測吸光度(A)。OGD16 h的A值與OGD0h的A值比較，計算每組細胞存活率。檢測實驗重復三次。

1.2.7 Smad7和ActA的蛋白水平檢測 神經(jīng)元樣PC12細胞，經(jīng)OGD16h處理的陽性及陰性轉染組細胞分別消化離心，利用含有1% PMSF的RIPA裂解提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，而后分別用兔抗大鼠Smad7(1∶500)和ActA(1∶500)一抗4℃過夜孵育，洗膜，羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2 h，ECL顯影壓膠片。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Smad7 siRNA沉默效果檢測

應用Real Time RT-PCR檢測Smad7 mRNA的表達變化，陽性轉染組Smad7 mRNA表達水平(0.32±0.13)較陰性轉染組顯著下調(0.68±0.14)(見圖1)。

* 與陽性轉染組比較P<0.05

2.2 Smad7 及ActA蛋白水平的表達檢測

siRNA轉染24 h，Smad7及ActA蛋白表達檢測顯示：OGD16h，siRNA陽性轉染組Smad7蛋白表達(0.35±0.08)與陰性組(1.17±0.12)比較，顯著下調。OGD后ActA蛋白表達上調，以陽性轉染組為著(對照組：0.94±0.10，陰性轉染組+OGD16h：1.29±0.13，陽性轉染組+OGD16h：2.46±0.16)(見圖2)。

圖2 Smad7、ActA 蛋白表達檢測

2.3 細胞存活率MTT檢測

OGD16h后MTT細胞存活率檢測結果顯示：陽性轉染組(90.68%±1.31%)與陰性轉染組(80.56%±2.13%)及空轉染組相比(78.3%±1.72%)，存活細胞比例顯著升高(見圖3)。

* 與陽性轉染組比較P<0.05

3 討論

國內外研究及本課題組的前期工作均證實ActA的抗缺血損傷神經(jīng)保護作用。目前研究表明，其信號轉導機制主要為Smads家族蛋白將胞外信號傳遞至胞內繼而調控核內基因的表達[4]。在該通路信號轉導過程中，Smads蛋白作為重要結點，一方面，膜受體激活的Smads2/3和通用Smads(common mediator Smads，Co-Smads)作為信號轉導通路的細胞內傳遞因子發(fā)揮著級聯(lián)反應功能，另一方面通過抑制性Smads(Smad6/7)，抑制該通路的激活過程[5，6]。在非神經(jīng)細胞模型的研究中，Smad7主要通過與抑制性Smads競爭結合TGF-βI型受體以及促進TGF-βI型受體去磷酸化而發(fā)揮負性調節(jié)作用[7，8]。但Smad7基因對神經(jīng)細胞缺血性損傷及其相關的ActA/Smads通路活化的影響目前尚不明確。為此，本研究利用RNA干擾技術，體外設計合成靶向大鼠Smad7基因的siRNA，通過脂質體轉染技術，瞬時轉染神經(jīng)元樣PC12細胞，繼而對Smad7在轉錄及蛋白水平的表達、細胞對OGD損傷的敏感性及ActA/Smads通路的活化水平進行研究。結果發(fā)現(xiàn)，PC12細胞經(jīng)外源性siRNA瞬時轉染后，經(jīng)實時定量PCR及蛋白印記檢測均證實細胞內Smad7基因在mRNA及蛋白水平的表達均明顯下調，細胞OGD損傷后的存活率升高，與陰性轉染組及空轉染組相比有顯著差異。

本研究進一步對ActA蛋白的表達情況進行了檢測，以明確ActA/Smads通路的活化水平,結果顯示OGD損傷刺激激活了調細胞內初級ActA蛋白合成，且此過程受Smad7基因的負向調節(jié)。考慮到細胞外ActA是該信號通路的始動因素，目前研究結果提示了ActA/Smads通路活化可能存在著一定程度的環(huán)路(反饋)調節(jié)，在OGD損傷過程中通過正反饋促進ActA基因表達，維持通路活性，但該機制又受到Smad7基因的負性調控，其途徑一方面可能是通過經(jīng)典機制下調通路活化程度，另一方面可能也與Smad7可以結合核內DNA，干擾可發(fā)揮生物學功能性的Smads-DNA復合物形成有關[9]。但Smad7對ActA/Smads通路調控的確切機制仍有待于在時間水平上對神經(jīng)細胞缺血損傷這一動態(tài)過程中不同時間位點以及空間水平上在細胞核內的進一步探討和研究。

作者簡介：王一鳴(1993-)，男，吉林長春人，吉林大學白求恩醫(yī)學部臨床醫(yī)學專業(yè)本科生。

參考文獻：

[1]Massagué J,Seoane J,Wotton D.Smad transcription factors[J].Genes Dev,2005,19(23):2783.

[2]Schubert D,Kimura H,LaCorbiere M,et al.Activin is a nerve cell survival molecule[J].Nature,1990,344(6269):868.

[3]He Jin-Ting,Mang Jing,Mei Chun-Li,et al.Neuroprotective Effects of Exogenous Activin A on Oxygen-Glucose Deprivation in PC12 Cells[J].Molecules,2011,17(1):315.

[4]Mukerji SS,Rainey RN,Rhodes JL,et al.Delayed activin A administration attenuates tissue death after transient focal cerebral ischemia and is associated with decreased stress-responsive kinase activation[J].J Neurochem,2009,111(5):1138.

[5]Schmierer B,Hill CS.TGF beta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(12):970.

[6]Mukerji SS,Katsman EA,Wilber C,et al.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice [J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(6):1161.

[7]Kato S,Ueda S,Tamaki K,et al.Ctopic expression of Smad7 inhhibit strans-forming growth factor responses in vascular smooth muscle cells[J].Life Sci,2001,69(22): 2641.

[8]Ebisawa T,Fukuchi M,Murakami G,et al.Smurf1 interacts with transforming growth factor-beta type I receptor through Smad7 and induces receptor degradation[J].J Biol Chem,2001,276:12477.

[9]Zhang S,Fei T,Zhang L,et al.Smad7 antagonizes TGF-β signaling in the nucleus by interfering with functional Smad-DNA complex formation[J].MCB,2007,27(12):4488.