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        電針豐隆穴對高脂血癥大鼠腹腔巨噬細(xì)胞MCP-1、IL-1γ 表達(dá)的影響*

        2014-08-23 05:56:22田佳玉陳盈芳張紅星湖北省武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院湖北武漢430022
        中國中醫(yī)急癥 2014年7期
        關(guān)鍵詞:豐隆高脂高脂血癥

        田佳玉 陳盈芳 王 瓊 肖 穎 樂 薇 張紅星(湖北省武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,湖北 武漢 430022)

        電針豐隆穴對高脂血癥大鼠腹腔巨噬細(xì)胞MCP-1、IL-1γ 表達(dá)的影響*

        田佳玉 陳盈芳 王 瓊 肖 穎 樂 薇 張紅星△(湖北省武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,湖北 武漢 430022)

        目的 觀察電針豐隆穴對高脂血癥大鼠單核趨化因子(MCP-1)、白細(xì)胞介素1γ(IL-1γ)含量的影響。方法 將40只健康SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、高脂飼料組、高脂+普通飼料組、高脂飼料治療組及高脂+普通飼料治療組,每組8只。正常組喂普通飼料,其余4組采用高脂飲食飼料飼喂法建立高脂血癥大鼠模型,造模28 d后,高脂+普通飼料組、高脂+普通飼料治療組改用普通飼料喂養(yǎng),其余3組飼喂方法不變,同時高脂飼料治療組及高脂+普通飼料治療組電針豐隆穴,疏密波,頻率為2/100 Hz,電流強(qiáng)度2 mA,治療30 min,每日1次,連續(xù)治療28 d。治療結(jié)束后,檢測各組大鼠血脂水平,即總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量,流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及酶聯(lián)免疫吸附法(ELASA)檢測各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中單核趨化因子(MCP-1)、白細(xì)胞介素1γ(IL-1γ)的表達(dá)。結(jié)果 高脂飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與正常對照組相比明顯上升(P<0.01);高脂+普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與高脂飼料組相比較明顯下降(P<0.01),較正常對照組仍明顯升高(P<0.01);電針豐隆穴治療后,高脂飼料治療組與高脂飼料組相比較,TC和LDL-C明顯降低(P<0.01),高脂+普通飼料治療組大鼠血漿中TC、LDL-C與高脂+普通飼料組相比較,明顯降低(P<0.01)。高脂飼料組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞、MCP-1及IL-1γ的表達(dá)較正常對照組顯著升高(P<0.01);高脂+普通飼料組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞、MCP-1及IL-1γ的表達(dá)較高脂飼料組明顯下降(P<0.05),但仍較正常組明顯升高(P<0.05或P<0.01);高脂+普通飼料治療組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞、MCP-1及IL-1γ的表達(dá)較高脂飼料治療組顯著下降(P<0.01)。結(jié)論 電針豐隆穴能夠明顯下調(diào)高脂血癥大鼠巨噬細(xì)胞、MCP-1、IL-1γ的表達(dá),對高脂血癥具有一定的治療作用。

        高脂血癥 電針 豐隆穴 巨噬細(xì)胞 單核趨化因子1 白細(xì)胞介素1γ

        高脂血癥是常見的代謝與內(nèi)分泌疾病,同時也是動脈粥樣硬化(AS)、冠心病(CHD)等相關(guān)疾病的病理基礎(chǔ),發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,嚴(yán)重影響人類身體健康[1]。另外,它與心腦血管、腎臟疾病的發(fā)病率、死亡率之間存在著明顯的相關(guān)性。目前對高脂血癥的治療,臨床上主要采用他汀類、貝特類、煙酸類及樹脂類等調(diào)脂藥物,其調(diào)脂作用、力度各不相同,且容易引起肝、腎損害等不良反應(yīng)[2]。大量的臨床研究表明,針刺作為非藥物療法治療高脂血癥有著無法替代的治療效果[3]。本研究通過觀察電針高脂血癥大鼠的豐隆穴,對其腹腔巨噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞內(nèi)單核趨化因子(MCP-1)、白細(xì)胞介素1γ(IL-1γ)含量的影響,進(jìn)一步明確電針在治療高脂血癥中的作用?,F(xiàn)報告如下。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康SD大鼠40只,雄性,體質(zhì)量180~200 g,由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物合格證號[SCXK(鄂)2008-0004]。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將40只SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組8只大鼠,即正常對照組、高脂飼料組、高脂飼料治療組、高脂+普通飼料組及高脂+普通飼料治療組。

        1.2 主要藥品與儀器 流式細(xì)胞儀(美國ABI公司),抗大鼠CD11 b-PERCP單克隆抗體 (美國eBioscience公司),抗大鼠MCP-1-PE單克隆抗體 (美國eBioscience公司),1640培養(yǎng)液,PBS緩沖液(美國HyClone公司),Ionomycin,莫能霉素(美國 ENZO 公司),PMA,皂苷 (美國Amresco公司),0.1%BSA (瑞士Roche公司),多聚甲醛 (美國SIGMA公司),大鼠白介素1γ(IL-1γ)ELISA試劑盒(伊萊瑞特公司),全自動酶標(biāo)儀 (Thermo scientific實(shí)驗(yàn)室),LH202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華威有限公司),型號S3210 32號1寸健衛(wèi)士牌不銹鋼針灸針 (中美合作泰成科技發(fā)展有限公司)。

        1.3 動物造模 正常對照組大鼠用普通大鼠飼料自然喂養(yǎng),其余4組大鼠用高脂飼料喂養(yǎng),飼料組成:豬油10%,蛋黃粉5%,膽固醇1%,丙基硫氧嘧啶0.2%,脫氧膽酸鈉0.5%,蔗糖5%,基礎(chǔ)飼料78.3%[4]。喂養(yǎng)28 d后,其中高脂+普通飼料組及高脂+普通飼料治療組換成普通飼料喂養(yǎng),同時對高脂飼料治療組及高脂+普通飼料治療組大鼠進(jìn)行電針豐隆穴治療。

        1.4 治療方法 取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5],模擬人體經(jīng)穴定位后,選取大鼠雙側(cè)豐隆穴。豐隆穴在大鼠膝關(guān)節(jié)外側(cè)后三里下1 mm,腓骨小頭下約5 mm處。用1寸針灸針,對豐隆穴直刺7 mm,快速捻轉(zhuǎn)至針下有沉澀感后,接韓式穴位神經(jīng)刺激儀,調(diào)至等幅疏密波,頻率為2/100 Hz,電流強(qiáng)度2 mA,以大鼠肢體微顫為度,每次治療時間為30 min,每日1次,連續(xù)治療28 d。

        1.5 血脂檢測 5組大鼠在干預(yù)第56日后,均禁食不禁水12 h,經(jīng)頸動脈用肝素鈉試管采血4~5 mL。標(biāo)本送至武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科,采用Olympus AU2700型全自動生化分析儀,根據(jù)各指標(biāo)試劑盒說明書,檢測血漿中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。

        1.6 流式細(xì)胞儀檢測大鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)MCP-1的分子表達(dá)水平 (1)提取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞:參照蘭青等[6]的方法提取SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,具體步驟如下:頸椎脫臼處死大鼠,手提大鼠尾部將全鼠浸入70%酒精中,浸泡5 min后,再將其倒立提出,從大鼠腹腔一側(cè)近腹股溝處注射1640培養(yǎng)液30~50 mL,將大鼠仰臥平放并用手指輕揉腹部3 min,靜置5 min后,置大鼠于超凈工作臺上并打開大鼠腹腔,觀察其腸管變扁且腹腔液為淡黃色時,用無菌滴管吸取其腹腔液約10 mL,1200 r/min離心8 min。去上清后,留下離心管底部乳白色沉淀物,繼以1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。(2)固定及染色:將分離后的巨噬細(xì)胞液加至96孔U 型板,0.2×107/mL, 加入 PMA (5 ng/mL)、ionomycin(500ng/mL)和莫能霉素(Monensin)(終濃度為 2μmol/L)置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞,PBS洗1次,本實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)胞表面抗原染色用的熒光標(biāo)記的CD11 b抗體,可與巨噬細(xì)胞特異性結(jié)合,從而能夠反映出大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的含量。調(diào)整細(xì)胞濃度1×10/mL,50 μL細(xì)胞加入抗CD11 b抗體,4℃孵育30 min,PBS洗2次,4%多聚甲醛固定4℃,30 min。PBS洗2次,第2次用含0.1%的皂苷,0.1%BSA的PBS洗細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度 1×107/mL,50 μL 細(xì)胞加入 MCP-1 抗體,4℃孵育30 min,PBS洗 2次,PBS重懸細(xì)胞至0.3 mL,流式細(xì)胞儀檢測。(3)設(shè)置流式檢測對照:①空白孔2×105/0.3 mL細(xì)胞;②2×105/0.3 mL細(xì)胞加CD11 b抗體;③2×105/0.3 mL細(xì)胞加MCP-1抗體;④2×105/0.3 mL細(xì)胞加CD11 b抗體+MCP-1二標(biāo)。

        1.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELASA)檢測 檢測大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IL-1γ的含量。從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條,未用的板條和干燥劑放回鋁箔袋內(nèi)壓實(shí)自封條,密封口袋,4℃,空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)本通用稀釋液,其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 μL/孔),用封板膠紙封住反應(yīng)孔,36 ℃孵箱孵育90 min,提前20 min準(zhǔn)備生物素化抗體工作液,洗板5次,空白孔加生物素化抗體稀釋液,其余孔加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔),用新封板膠紙封住反應(yīng)孔,36℃孵箱孵育60 min,提前20 min準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液,避光室溫(22~25℃)放置,洗板5次,空白孔加酶結(jié)合物稀釋液,其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100 μL/孔),用新封板膠紙封住反應(yīng)。加入顯色底物(TMB)100 μL/孔,避光 36℃孵箱,避光孵育 15 min,加入終止液50 μL/孔,混勻后即刻測量OD450值。將標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值做縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計算各組樣本濃度值。

        1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析,繼以LSD檢驗(yàn),計量資料以(±s)表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組大鼠血脂水平的比較 由表1可以看出,高脂飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與正常對照組相比明顯上升(P<0.01),而 TG和 HDL-C無明顯變化(P>0.05);高脂+普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C與高脂飼料組相比較明顯降低(P<0.01),較正常對照組仍明顯升高(P<0.01);高脂飼料治療組與高脂飼料組相比較,TC 和 LDL-C 明顯降低(P<0.01),高脂+普通飼料治療組大鼠血漿中TC、LDL-C與高脂+普通飼料組相比較,明顯降低(P<0.01),而血漿TG和HDL-C無明顯變化(P>0.05)。

        表1 各組大鼠血脂水平比較(mmol/L,±s)

        表1 各組大鼠血脂水平比較(mmol/L,±s)

        組 別 n正常對照組 8高脂飼料組 8高脂+普通飼料組 8 TC TG HDL-C LDL-C 1.61±0.33 0.56±0.24 0.84±0.09 0.28±0.08 10.98±3.05** 0.68±0.21 0.62±0.21 5.48±1.06**6.77±1.08**△△ 0.61±0.18 0.65±0.19 2.80±0.64**△△高脂飼料治療組 8 5.12±0.81**△△ 0.58±0.19 0.69±0.15 1.27±0.37*△△高脂+普通飼料治療組 8 3.02±0.38△▲▲ 0.58±0.18 0.72±0.13 0.79±0.49△▲▲

        與正常對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與高脂飼料組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與高脂+普通飼料組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。 下同。

        2.2 各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞含量及細(xì)胞內(nèi)MCP-1的比較 由表2可以看出,高脂飼料組大鼠巨噬細(xì)胞含量及巨噬細(xì)胞內(nèi)MCP-1表達(dá)率較正常對照組明顯上升(P<0.01),高脂+普通飼料組大鼠巨噬細(xì)胞含量及巨噬細(xì)胞內(nèi)MCP-1表達(dá)率較高脂飼料組明顯下降(P<0.05),較正常組仍明顯上升 (P<0.05或 P<0.01),高脂飼料治療組與高脂飼料組相比較,巨噬細(xì)胞含量及巨噬細(xì)胞內(nèi)MCP-1表達(dá)率明顯下降 (P<0.01),高脂+普通飼料治療組與高脂+普通飼料組相比較,巨噬細(xì)胞含量及巨噬細(xì)胞內(nèi)MCP-1表達(dá)率明顯降低(P<0.01),高脂+普通飼料治療組與高脂飼料治療組比較,巨噬細(xì)胞含量及巨噬細(xì)胞內(nèi)MCP-1表達(dá)率明顯降低(P<0.01)。

        表2 各組大鼠巨噬細(xì)胞含量及巨噬細(xì)胞內(nèi)MCP-1 表達(dá)率比較(%,±s)

        表2 各組大鼠巨噬細(xì)胞含量及巨噬細(xì)胞內(nèi)MCP-1 表達(dá)率比較(%,±s)

        組 別 n正常對照組 8高脂飼料組 8高脂+普通飼料組 8 CD11b MCP-1 16.29±1.73 2.88±0.42 65.14±3.74** 24.88±5.44**48.73±2.27**△ 13.77±0.87*△高脂飼料治療組 8 36.91±2.54**△△▲▲ 8.43±0.55△△高脂+普通飼料治療組 8 26.49±2.12*△△▲▲ 6.30±0.82*▲▲

        2.3 各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IL-1γ的比較 見表3。結(jié)果示高脂飼料組大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1γ濃度較其余4組顯著上升(P<0.01),高脂+普通飼料組大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1γ濃度較正常對照組仍明顯上升 (P<0.05),高脂飼料治療組較高脂+普通飼料組相比較,IL-1γ濃度顯著降低(P<0.01),高脂+普通飼料治療組與高脂+普通飼料組及高脂飼料治療組比較,IL-1γ濃度顯著降低(P<0.01)。

        表3 各組大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1γ濃度比較(nmol/mL,±s)

        表3 各組大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1γ濃度比較(nmol/mL,±s)

        組 別 n正常對照組 8高脂飼料組 8高脂+普通飼料組 8 IL-1γ 26.27±1.20 47.10±1.52**40.82±0.84*△高脂飼料治療組 8 35.01±0.64△▲▲高脂+普通飼料治療組 8 30.42.30±0.49△▲

        3 討 論

        高脂血癥屬于中醫(yī)學(xué)“痰濁”、“瘀血”范疇,形成的外因多是由于嗜食肥甘、膏粱厚味,內(nèi)因主要是脾腎運(yùn)化輸布不調(diào),肝膽疏泄失暢。因此,高脂血癥與高血壓病、冠心病、腦血管病及肥胖癥關(guān)系密切[7-8]。

        豐隆穴始見于 《靈樞·根結(jié)》,是足陽明胃經(jīng)的絡(luò)穴,功能主要是化痰降濁、健脾通腑,可宣通脾胃兩經(jīng)的氣機(jī),脾為生痰之源,脾胃若運(yùn)行正常則痰無所生?!队颀埜琛吩啤疤刀嘁讼蜇S隆尋”,可見豐隆穴為化痰的首選穴。大量實(shí)驗(yàn)表明,中醫(yī)的“痰”與自由基代謝異常有關(guān),而豐隆穴的化痰作用除了能夠調(diào)節(jié)血脂代謝,還能夠改善機(jī)體的自由基代謝[9]。

        高脂血癥的形成主要是由于脂質(zhì)代謝紊亂。高脂血癥是AS形成最主要的危險因素,而炎癥反應(yīng)貫穿了AS形成過程的始終[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,電針豐隆穴治療高脂血癥大鼠后,大鼠血漿TC、LDL-C明顯降低,說明針刺豐隆穴下調(diào)血脂的作用是十分顯著的。此外,高脂+普通飼料組大鼠血漿TC、LDL-C較高脂飼料組明顯下降,說明了一定程度的控制高脂飲食對高脂血癥的具有一些干預(yù)作用。

        血脂代謝的異常與炎癥反應(yīng)、炎癥細(xì)胞因子之間存在著密切的聯(lián)系,單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是AS形成的第一個環(huán)節(jié)。單核細(xì)胞主要依賴其表面抗原CD11 b與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行黏附。有研究表明[11],活化的單核細(xì)胞上的CD11 b的表達(dá)率顯著上升,其在巨噬細(xì)胞的黏附、活化過程中發(fā)揮著重要作用,CD11 b表達(dá)量的改變能夠反映巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)。此外,有研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體MCP-1的含量與血漿膽固醇水平有關(guān)[12]。MCP-1屬于趨化因子家族中的β家族,主要來源于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞,巨噬細(xì)胞在MCP-1的趨化作用下進(jìn)入炎癥區(qū);除此之外,MCP-1表達(dá)的升高能增強(qiáng)多種細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)與合成,能上調(diào)單核細(xì)胞表面特異性黏附分子CD11 b的表達(dá)、激活白細(xì)胞黏附分子1的表達(dá)以及促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1、IL-6產(chǎn)生等作用,從而增強(qiáng)其黏附性而加重了組織損傷[13];相反IL-1也能誘導(dǎo)MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá),它們通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MCP-1,趨化單核細(xì)胞進(jìn)入動脈內(nèi)膜,從而參與動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展[14]。

        本實(shí)驗(yàn)提示,高脂飼料組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞及其內(nèi)MCP-1及IL-1γ的表達(dá)較正常對照組顯著升高(P<0.01),推測此時高脂血癥大鼠處于炎癥狀態(tài),其巨噬細(xì)胞表達(dá)增加,分化變強(qiáng)。高脂+普通飼料組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞及其內(nèi)MCP-1及IL-1γ的表達(dá)較高脂飼料組明顯下降(P<0.05),但其仍較正常組明顯升高(P<0.05),說明一定的飲食控制在治療高脂血癥方面有重要的干預(yù)作用,但單純的飲食控制尚有局限[15],所以仍需結(jié)合針灸治療來下調(diào)血脂水平。高脂+普通飼料治療組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞、MCP-1及IL-1γ的表達(dá)較高脂飼料治療組顯著下降(P<0.01),筆者推測電針豐隆穴能夠能抑制大鼠腹腔巨噬細(xì)胞MCP-1表達(dá),從而間接影響到IL-1γ的表達(dá),而降低上述炎癥因子的含量,從而減輕了炎癥反應(yīng)。然而這一過程涉及的機(jī)制十分復(fù)雜,尚需更深入的研究與探索。

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        Effect of Electroacupuncture at Fenglong (ST40) Acupoint on the Expression of MCP-1 and IL-1γ in Macrophages of Hyperlipidemic Rats

        TIAN Jiayu,CHEN Yingfang,WANG Qiong,et al.Wuhan University of Traditional Chinese Medicine,Hubei,Wuhan430022,China

        Objective:To explore the effect of electroacupuncture at Fenglong (ST40) acupoint on inflammatory factors MCP-1 and IL-1γ of rats with hyperlipemia(HLP).Methods:40 health SD rats were randomied into normal control group,high fat feed group,high fat+normal feed group,high fat feed treatment group,and high fat+normal feed treatment group,with 8 rats in each group.The high fat feed group was eatablished by feeding the animals with high fat forage for 28 days.After modeling,rats of high fat+normal feed group and high fat+normal feed treatment group were fed bassl forage.EA(2 mA,2 Hz/100 Hz) was applied to bilateral Fenglong(ST40)for 30 min,once daily for 28 days.After electro-acupuncture at Fenglong acupoint for 28 days,blood fat level,total cholesterol(TC),triglyceride(TG),low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C),and high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C) were tested.Flow cytometry(FCM) and enzyme-linked immunosorbent assay(ELASA) were applied to observe changes of the expression of MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats.Results:The content of TC and LDL-C showed an apparent increase in high fat feed group as compared with normal control group and high fat+normal feed group (P<0.01).There were significant reductions in the content of TC and LDL-C after the treatment(P<0.01).The expression of MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats showed an apparent increase in high fat feed group as compared with normal control group (P<0.01)and high fat+normal feed group (P<0.05)and high fat+normal feed group still showed an apparent increase com-pared with normal control group (P<0.05 or P<0.01).Compared with high fat feed treatment group,the expression of macrophages,MCP-1 and IL-1γ in macrophages of hyperlipidemic rats decreased obviously in high fat+normal feed treatment group.Conclusion:Electro-acupuncture at Fenglong acupoint can not ably decrease the expression of macrophages as well as MCP-1 and IL-1γ in macrophages,thereby it has therapeutical effect on hyperlipemia.

        Hyperlipemia;Electroacupuncture;Fenglong(ST40) Acupoint;Macrophages;MCP-1;IL-1γ

        R245.9+7

        A

        1004-745X(2014)07-1212-04

        10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.002

        國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30873309)

        △通信作者

        2014-03-26)

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