李 靖 鄧少榮 曾建武 劉亞萍 安淞麟 吳云霞△

1武警湖北總隊(duì)醫(yī)院急診科，武漢 430060

2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院湖北省天然藥化與資源評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030

中醫(yī)藥在治療不孕癥方面積累了深厚的理論基礎(chǔ)和豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，其應(yīng)用在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET)技術(shù)中顯示了良好的促著床效果。促孕復(fù)方(黃芪、黃芩、續(xù)斷、白術(shù))為課題組長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)方，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)超排卵(controlled ovarian stimulation，COS)刺激方案下小鼠的胚胎著床有良好的促進(jìn)作用。本研究對(duì)促孕復(fù)方進(jìn)行梯度極性系統(tǒng)的萃取和柱層析分離，最終得到活性部位成分DS-147[1-3]，運(yùn)用COS著床障礙動(dòng)物模型進(jìn)一步篩選DS-147中各組分促著床活性，最終優(yōu)化促孕復(fù)方達(dá)到減毒增效的作用。

1 材料與方法

1.1 藥材

黃芪(RadixAstragaliMongolici，產(chǎn)地內(nèi)蒙古)，續(xù)斷(RadixDipsaci，產(chǎn)地四川)，白術(shù)(RhizomaAtractylodisMacrocephalae，產(chǎn)地浙江)，黃芩(RadixScutellariaeBaicalensis，產(chǎn)地內(nèi)蒙古)，以上中藥材均購(gòu)于武漢江瀚大藥房并經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥系汪建平博士鑒定。

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)藥物

常用試劑石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、甲醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；孕馬血清(PMSG，寧波第二激素廠，批號(hào)：081020)；注射用絨毛膜促性腺激素(HCG，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，批號(hào)：090103A)；硅膠(200-300目，青島海洋化工廠)。

1.3 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5205，RE-52 AA型，上海亞榮生化儀器廠)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-ⅢS，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；AG2 China萬(wàn)分之一天平(瑞士METTLER公司)；硅膠GF254薄層板(青島海洋化工廠)。

1.4 促孕復(fù)方活性部位DS-147的制備

1.4.1 促孕復(fù)方不同極性部位的制備 按復(fù)方配伍比例稱(chēng)取黃芪、續(xù)斷、白術(shù)、黃芩中藥飲片，第1次加10倍量60%乙醇(前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)效果最好)，第2、3次依次用8、6倍量的60%乙醇各回流提取3 h，過(guò)濾后合并濾液，減壓濃縮至2.0 L。取1.5 L濃縮液依次經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別得到石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各部位減壓濃縮成為浸膏，再經(jīng)冷凍干燥后成粉末備用。另0.5 L濃縮液經(jīng)冷凍干燥后成粉末(促孕復(fù)方總提物)備用。見(jiàn)圖1。

圖1 萃取流程圖

1.4.2 乙酸乙酯部位的硅膠柱層析分離

取乙酸乙酯部位干燥粉末30 g，用60 g硅膠拌好樣后，加入到已靜置好的硅膠柱中(樣品∶硅膠=1∶10)，加好樣品后樣品層平整，無(wú)氣泡。乙酸乙酯部位采用二氯甲烷和甲醇溶液從40∶1到1∶1梯度洗脫(以2個(gè)比例遞減洗脫)，每個(gè)洗脫比例加入的溶劑量為4個(gè)柱體積，最終用甲醇沖洗剩余樣品。洗脫樣品經(jīng)薄層鑒別合并共收集到了30個(gè)流分。見(jiàn)圖2。

圖2 柱層析圖

據(jù)相關(guān)研究，促孕復(fù)方中黃酮類(lèi)和皂苷類(lèi)化合物具有促著床活性，因此本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)初步的化學(xué)成分鑒別反應(yīng)，從30個(gè)流分中選擇富含黃酮類(lèi)或皂苷類(lèi)的洗脫流分。方法是將收集的30個(gè)流分進(jìn)行初步化學(xué)成分鑒別和TLC鑒別合并。分別取各組分溶液，按下列方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。黃酮類(lèi)化合物的鑒別：①鹽酸-鎂粉反應(yīng)；②三氯化鋁反應(yīng)；③堿性試劑顯色反應(yīng)。皂苷類(lèi)化合物的鑒別：①醋酐-濃硫酸反應(yīng)；②氯仿-濃硫酸反應(yīng)；③泡沫反應(yīng)。

經(jīng)過(guò)初步的化學(xué)成分鑒別反應(yīng)，從30個(gè)流分中篩選對(duì)黃酮類(lèi)或皂苷類(lèi)有陽(yáng)性反應(yīng)的洗脫流分(40∶1，38∶1，36∶1，28∶1，16∶1，12∶1，2∶1，1∶1洗脫部分)，用于后續(xù)的促著床藥理活性篩選。篩選得到14個(gè)流分的混合物DS-147，促著床藥物DS-147最終濃度為25 mg/ml，保存在4 ℃下備用。

1.5 COS著床障礙小鼠模型的建立

選用清潔級(jí)、健康昆明小鼠，雌性未交配過(guò)，雄性證明有生育能力，年齡8～12周，體重20～25 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2010-0007(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部)。雌、雄小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，自然光照，溫度23～25 ℃，濕度40%～60%，當(dāng)小鼠喂養(yǎng)至體重為(30±2) g后，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

采用聯(lián)合注射PMSG和HCG的方法建立胚胎著床障礙小鼠模型，將喂養(yǎng)至體重為(30±2) g的小鼠，第1天17：00 pm注射PMSG 10 IU/只，48 h后注射HCG 10 IU/只，按雌雄比例1∶1合籠，次日8：00 am檢查雌鼠陰道，發(fā)現(xiàn)有陰栓形成的為造模成功小鼠，計(jì)為妊娠第1天(PD1)。

1.6 DS-147中各組分促著床活性的研究

DS-147中包含有14個(gè)富含黃酮類(lèi)或皂苷類(lèi)的洗脫流分，為進(jìn)一步驗(yàn)證DS-147中14組分是否為促著床必不可少組分，采用去一法和單一法對(duì)其活性進(jìn)一步篩選確定。單一法為單獨(dú)對(duì)DS-147中14個(gè)組分的促著床效果進(jìn)行篩選，去一法為去掉DS-147中14組分的任一組分，來(lái)觀察剩余組分組合的促著床效果。

將發(fā)現(xiàn)有陰栓形成的雌鼠，每組6只，隨機(jī)分組，依次為COS模型組、黃體酮組、DS-147單一組分給藥組和DS-147去一組分給藥組。另取未經(jīng)注射PMSG和HCG，自然交配形成陰栓的小鼠8只為正常對(duì)照組。正常組和模型組灌胃給予相應(yīng)體積的生理鹽水(20 ml/kg·d)，給藥組依次灌胃給予相應(yīng)藥物。各組于妊娠PD1開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥8 d(PD1～PD8)。于妊娠PD8頸椎脫臼處死小鼠，剖腹，觀察著床胚泡數(shù)(平均著床胚泡數(shù)=總著床胚泡數(shù)/孕鼠數(shù))，并計(jì)算妊娠率[妊娠率=(孕鼠數(shù)/受試動(dòng)物數(shù))×100%]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 促孕復(fù)方不同極性部位促著床效果觀察

篩選結(jié)果表明促孕復(fù)方促著床最有效的部位為乙酸乙酯部位，乙酸乙酯中、高劑量組的妊娠率與模型組相比顯著升高(P<0.05)。氯仿、正丁醇和水部位與模型組相比妊娠率也有一定程度提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育較小，效果較促孕復(fù)方組明顯降低。見(jiàn)表1。

2.2 DS-147對(duì)COS小鼠的促著床作用觀察

模型組妊娠率、平均著床點(diǎn)數(shù)和子宮重量較正常組均明顯降低(P<0.01，P<0.01，P<0.001)；DS-147組和黃體酮組3項(xiàng)觀察指標(biāo)與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.001；P<0.01，P<0.05，P<0.001)；DS-147組和黃體酮組的各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表1 促孕復(fù)方及其不同極性部位促著床活性

表2 妊娠PD8妊娠率和平均著床點(diǎn)數(shù)的比較

2.3 DS-147中14組分單獨(dú)促著床活性篩選

單一法和去一法各組分的給藥劑量確定為200 mg/kg，與DS-147最佳劑量一致。在妊娠PD8觀察給予不同組分的小鼠妊娠情況，發(fā)現(xiàn)DS-147中的單一組分對(duì)COS小鼠的妊娠率與模型組相比并沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明14個(gè)單獨(dú)組分均不能單獨(dú)提高小鼠的胚泡著床。DS-147中14個(gè)混合組分去掉其中的任何一個(gè)組分，COS后小鼠的妊娠率均顯著下降。表明14個(gè)組分均對(duì)超排卵后小鼠的胚泡著床發(fā)揮著不可替代的作用，是通過(guò)協(xié)同作用發(fā)揮促著床效果。見(jiàn)圖3-4。

與模型組比較*P<0.05

與模型組比較*P<0.05，** P <0.01，*** P<0.001

3 討論

以IVF-ET為中心的輔助生殖技術(shù)近年來(lái)迅速發(fā)展，在臨床得到了廣泛的應(yīng)用,然而ET后胚胎著床障礙依然是限制此項(xiàng)技術(shù)發(fā)展的瓶頸。因此,尋找提高COS后胚胎著床率的藥物成為生殖領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。控制性COS為IVF-ET的核心步驟，但COS被證明有明顯降低內(nèi)膜容受性、影響胚泡著床及影響妊娠結(jié)局的不利作用。目前國(guó)內(nèi)外雖然建立了假孕及基因敲除著床障礙模型[4]，但這些模型均是阻斷著床的某一關(guān)鍵分子或環(huán)節(jié)而阻斷著床，不能模擬臨床IVF-ET著床障礙的實(shí)際情況，使其臨床應(yīng)用受到限制。課題前期運(yùn)用COS對(duì)著床的影響建立了有臨床實(shí)際意義的小鼠COS著床障礙模型[5]，運(yùn)用該模型建立篩選促進(jìn)著床藥物方法，篩選得到有效部位群組合物DS-147促進(jìn)著床效果明顯[6]，且未發(fā)現(xiàn)對(duì)正常妊娠有不良影響，使復(fù)方得以簡(jiǎn)化，去掉很多無(wú)效甚至毒性成分。本研究結(jié)果表明，通過(guò)恰當(dāng)?shù)哪Ｐ?結(jié)合臨床)，建立模型篩選方法，中藥方劑可以進(jìn)行優(yōu)化和簡(jiǎn)化，藥效可更強(qiáng)，而毒性并不增強(qiáng)。

促進(jìn)胚胎生長(zhǎng)、促進(jìn)子宮發(fā)育、提高內(nèi)膜容受性和抑制宮縮有利于胚胎著床，從而提高試管嬰兒和反復(fù)著床失敗婦女的妊娠率，促孕復(fù)方所用中藥為2010藥典所載且為臨床妊娠常用較安全藥材，方中首選黃芪為君藥，黃芩當(dāng)為要藥，白術(shù)、續(xù)斷為臣藥。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]報(bào)道，中藥黃酮類(lèi)和皂苷類(lèi)化合物均具有促進(jìn)胚胎著床作用。其中黃酮類(lèi)提高胚胎著床成功率的機(jī)制可能是其對(duì)激素-免疫-炎癥細(xì)胞因子及黏附分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)聯(lián)合作用的結(jié)果。皂苷類(lèi)則能顯著抑制子宮平滑肌自發(fā)收縮活動(dòng)，降低其收縮幅度和張力，并對(duì)抗卵巢功能不足導(dǎo)致的流產(chǎn)作用。以上研究結(jié)果提示，若充分排除中藥化學(xué)成分對(duì)患者和胎兒的毒性，以黃酮和皂苷類(lèi)成分為主的中藥有望成為治療早產(chǎn)、流產(chǎn)的良藥。因此本部分在乙酸乙酯促著床活性確定的基礎(chǔ)上，采用硅膠柱分離部位成分，化學(xué)鑒別初步篩選出含有黃酮類(lèi)或皂苷類(lèi)成分的流分，進(jìn)行后續(xù)的促著床藥理活性篩選。最終篩選得到的活性部位成分DS-147中總黃酮、總皂苷和多糖不僅是其主要組分[1]，而且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是其活性組分。

對(duì)DS-147分離出的14個(gè)組分進(jìn)行促著床藥理活性篩選，本結(jié)果表明，14組分均不能單獨(dú)發(fā)揮促進(jìn)胚胎著床作用。且在14個(gè)混合組分DS-147中，去掉任一組分，促著床效果均下降或消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，黃酮和皂苷各有效組分可能在相互促進(jìn)相互抑制的基礎(chǔ)上發(fā)揮各自的生理效應(yīng)，從而達(dá)到一個(gè)更適合胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的成分配比和濃度，協(xié)同發(fā)揮促進(jìn)胚胎著床作用。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中藥分離與藥理活性篩選結(jié)合的方法，創(chuàng)新性地運(yùn)用COS著床障礙模型及去一法與單一法結(jié)合篩選分離組分，確定了促孕復(fù)方促著床活性成分DS-147，其促著床活性較促孕復(fù)方原組方增強(qiáng)且未發(fā)現(xiàn)毒副作用。該研究為DS-147深入的化學(xué)成分和作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

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