朱勁華，賈曉斌，張 威*(.江蘇建康職業(yè)學(xué)院，南京 009；.江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 0097)

隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，肺癌的發(fā)生率和死亡率也急劇上升，成為人類健康的頭號殺手。目前，對肺癌最常用的保守治療方式還是放、化療，由于存在嚴(yán)重的耐藥性和機(jī)體損傷，療效甚微。而抗腫瘤中藥不易產(chǎn)生耐藥性，對機(jī)體的損傷較小。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物具有非常重要的意義。

夏枯草為唇形科植物夏枯草(PrunellavulgarisL.)的干燥果穗，含有多種藥理活性成分，主要包括萜類及其皂苷類、黃酮類、香豆素類、有機(jī)酸類、苯丙素類、揮發(fā)油、糖類等成分，具有清火、明目、散結(jié)、消腫之功效[1-2]?，F(xiàn)代臨床和藥理研究表明，夏枯草具有廣泛的抗腫瘤作用[3]，能抑制淋巴瘤[4-5]、結(jié)腸癌[6]、胰腺癌[7]、膀胱癌[8]、肺癌[9]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖。但關(guān)于夏枯草是如何誘發(fā)肺癌細(xì)胞凋亡的，能否抑制肺癌細(xì)胞的遷移，作者未見有相關(guān)報道。本研究選用江蘇地產(chǎn)夏枯草的干燥果穗為實驗材料，制備其乙醇提取物，以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為靶細(xì)胞，研究夏枯草乙醇提取物對肺癌細(xì)胞體外生長、遷移、細(xì)胞周期及凋亡的影響，旨在探討江蘇地產(chǎn)夏枯草乙醇提取物在肺癌臨床治療中的藥物價值，并為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 索氏提取儀(上海啟前電子科技有限公司)；BUCHI Rotavapor R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士)；DZF-6051型真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(Olympus，日本)；酶標(biāo)儀(Bio-TEK，美國)； FACScaliber流式細(xì)胞儀(BD Biosciences， 美國)。

1.2材料 江蘇地產(chǎn)夏枯草(Spicaprunellae，購于山農(nóng)，經(jīng)鑒定)；人類肺癌細(xì)胞株A549源自ATCC (美國模式培養(yǎng)物集存庫)，由本實驗室保存和培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(Hyclone， 美國)；胎牛血清(Hyclone， 美國)；Annexin-V FITC和PI雙染試劑盒(Invitrogen，美國)。

2 方法

2.1夏枯草乙醇提取物的制備 取夏枯草500 g，分批加10倍量的乙醇回流提取2次，每次2 h，過濾；殘渣再用10倍量的體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇回流提取2次，每次2 h，過濾；合并濾液并濃縮成浸膏， 60 ℃減壓干燥，并制成凍干粉。將藥物粉末溶于無水乙醇中，配成母液質(zhì)量濃度為5 g·L-1，并于4 ℃冰箱中避光保存。使用時，按照梯度稀釋法用相應(yīng)的完全培養(yǎng)基稀釋成所需質(zhì)量濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) A549腫瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)基為DMEM(含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清，100 mg·L-1鏈霉素，100 u·mL-1青霉素)，置于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

2.3MTT法檢測腫瘤細(xì)胞的存活率 取對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞(稀釋為8×103個·mL-1)，按每孔100 μL接種到96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置空白組、對照組和9組含不同質(zhì)量濃度的夏枯草的實驗組(夏枯草的終質(zhì)量濃度分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 mg·L-1)，每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)12，24和48 h，分別用MTT法檢測每孔的吸光度(A值)。按下式計算細(xì)胞在不同夏枯草質(zhì)量濃度作用下的存活率。

細(xì)胞存活率=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%

2.4細(xì)胞克隆形成實驗 將不同質(zhì)量濃度夏枯草(終質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0和4.0 mg·L-1)處理24 h的貼壁細(xì)胞計數(shù)后，分別接種至60 mm培養(yǎng)皿中，每組設(shè)3個平行樣，并繼續(xù)培養(yǎng)2～3周。待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的小克隆點時終止培養(yǎng)，棄上清，用PBS洗滌2次，加入甲醇3 mL，固定30 min，去固定液，加入3 mL Giemsa染色應(yīng)用液染色30 min，洗去染色液，空氣干燥。在顯微鏡下計數(shù)大于或等于50個細(xì)胞的克隆數(shù)，計算各劑量組的克隆形成率(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)以及存活率。

細(xì)胞存活率=(某劑量的克隆形成率/該劑量下種植的細(xì)胞數(shù)×對照組克隆形成率)×100%。

2.5倒置顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)的變化 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞(8×103個·mL-1)100 μL接種到96孔培養(yǎng)板中，設(shè)空白對照組(加100 μL培養(yǎng)液)和不同質(zhì)量濃度的夏枯草實驗組(終質(zhì)量濃度分別為1.5，3.0和4.0 mg·L-1)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h時，利用倒置顯微鏡觀察并拍照。

2.6細(xì)胞劃痕實驗觀察A549細(xì)胞遷移能力的變化 將細(xì)胞密度為5×105個·mL-1的A549細(xì)胞鋪于24孔板(每孔500 μL)上，加入含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使形成單層細(xì)胞。用10 μL移液槍槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用PBS清洗3次，設(shè)空白對照組(加100 μLPBS)和夏枯草不同質(zhì)量濃度的實驗組(終質(zhì)量濃度分別為0.5和1.0 mg·L-1)，孵育24 h，換成含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的培養(yǎng)液，孵育24和48 h，用PBS清洗3次，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.7流式細(xì)胞分析法檢測細(xì)胞周期的變化 將對數(shù)生長期細(xì)胞以每孔2×105個的密度接種至6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后，實驗組用不同質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物(終質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0和1.5 mg·L-1)處理24 h，對照組不加藥。離心收集懸浮細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇固定4 h，PBS洗滌2次。將細(xì)胞重懸于500 μL含300 μg·mL-1RNA酶的溴化丙啶(PI，10 μg·mL-1)溶液中，于冰上放置30 min，過濾，用FACSCaliber流式細(xì)胞儀和ModFit LTTM軟件對每份樣品的10 000個細(xì)胞的細(xì)胞周期分布進(jìn)行計算。

2.8夏枯草誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分析 使用Annexin-V FITC和PI雙染試劑盒分析夏枯草誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。使用不同質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物(終質(zhì)量濃度分別為0，25和50 mg·L-1)孵育A549細(xì)胞48 h，用含有EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。再用預(yù)冷的PBS洗滌后，每管加入1×binding buffer重懸細(xì)胞。用多聚甲醛固定，每管加入5 μL Annexin-V FITC和500 μL PI，混勻，避光孵育15 min。以400 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，美國)檢測。

3 結(jié)果

3.1夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞的生長抑制作用 見圖1。結(jié)果表明，夏枯草乙醇提取物對A549細(xì)胞生長抑制作用明顯，不同質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物對人肺癌A549細(xì)胞均有抑制作用，并隨著藥物劑量的增加，其抑制作用越明顯；同時，夏枯草乙醇提取物處理的時間越長，其細(xì)胞抑制作用也越明顯。夏枯草乙醇提取物抑制A549細(xì)胞生長的半數(shù)致死質(zhì)量濃度，即IC50，分別約為4.3(12 h)，3.6(24 h)和3.0 mg·L-1(48 h)。

圖1 MTT法檢測的夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用

細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果亦證實：一定質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物能顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力，且1.0，2.0和4.0 mg·L-1夏枯草乙醇提取物處理組的細(xì)胞存活率分別為66.37%±1.30%，1.49%±0.03%和0。

由以上實驗結(jié)果可知，夏枯草乙醇提取物具有明顯的體外抗腫瘤作用，可明顯抑制肺癌細(xì)胞的生長和增殖，且有顯著的量效和時效關(guān)系。

3.2夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞形態(tài)和生長密度的影響 見圖2。由圖2可知，與對照組相比，夏枯草乙醇提取物作用24 h后，A549的生長受到明顯的抑制，且隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制作用愈明顯。具體表現(xiàn)為：終質(zhì)量濃度為1.5，3.0和4.0 mg·L-1的夏枯草乙醇提取物對A549的生長有明顯的抑制作用，終質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1夏枯草乙醇提取物作用24 h后，與對照組相比，細(xì)胞密度明顯減小，形態(tài)變化不明顯；終質(zhì)量度為3.0 mg·L-1夏枯草乙醇提取物作用24 h后，與對照組相比，細(xì)胞密度減小得更加明顯，從形態(tài)上看大部分細(xì)胞變圓。終質(zhì)量濃度為4.0 mg·L-1夏枯草乙醇提取物作用24 h后，與對照組相比，細(xì)胞密度減小得最為明顯，從形態(tài)上看絕大部分細(xì)胞變圓。

圖2 不同質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞形態(tài)和生長密度的影響

3.3夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞體外遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果如圖3顯示，0.5和1.0 mg·L-12種質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物都能抑制肺癌A549細(xì)胞的體外遷移能力，且時間越長，抑制作用越明顯。

圖3 不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞體外遷移能力的影響

3.4夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞周期的影響 為了進(jìn)一步了解夏枯草乙醇提取物抑制肺癌細(xì)胞A549生長的作用機(jī)制，本實驗還通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測，以觀察不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物對肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的影響。

如表1結(jié)果所示，0.5 mg·L-1夏枯草乙醇提取物處理A549細(xì)胞24 h后，其G0/G1期細(xì)胞比例相比對照組有所增加，且這種改變經(jīng)t檢驗分析，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而G2/M期及S期細(xì)胞比例雖較對照組，均有所下降，但經(jīng)t檢驗分析后，P>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。1.5 mg·L-1夏枯草處理組，與對照組和1 mg·L-1夏枯草處理組相比，其G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升，G2/M期細(xì)胞比例亦上升，同時伴隨著S期細(xì)胞比例明顯下降。以上結(jié)果表明，夏枯草乙醇提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G0/G1期或G2/M期細(xì)胞周期阻滯，其中低質(zhì)量濃度(0.5 mg·L-1)表現(xiàn)為G0/G1期阻滯，中、高質(zhì)量濃度(1和1.5 mg·L-1)時，隨著夏枯草質(zhì)量濃度的增高，其G0/G1期和G2/M期細(xì)胞阻滯愈明顯。

表1 不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物作用于肺癌A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期的變化

周期阻滯的同時，隨著夏枯草質(zhì)量濃度的增高，其Sub G1峰比例亦呈明顯上升趨勢。如表2所示，0.5，1和1.5 mg·L-1夏枯草處理組的Sub G1峰比例分別為4.49%±0.13%，19.12%±1.78%和70.44%±3.14%，明顯高于對照組(1.60%±0.55%)，且各組間經(jīng)統(tǒng)計，P<0.05，表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義，呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。

表2 不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物作用于肺癌A549細(xì)胞Sub G1峰比例的變化

3.5夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 為進(jìn)一步研究夏枯草乙醇提取物誘發(fā)的肺癌細(xì)胞凋亡過程，遂采用了磷脂酰絲氨酸外翻法進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。Annexin V/PI雙染法將細(xì)胞分成4種屬性，其中Ⅰ象限(Annexin V-/PI+)為壞死細(xì)胞象限；Ⅱ象限(Annexin V+/PI+)為晚期凋亡細(xì)胞；Ⅲ象限(Annexin V-/PI-)為正常細(xì)胞象限；Ⅳ象限(Annexin V+/PI-)為早期凋亡象限。

通過檢測發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物(1.0，2.0和4.0 mg·L-1)作用A549細(xì)胞24 h，可誘導(dǎo)劑量依賴性地細(xì)胞凋亡，即隨著藥物劑量的增加，細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例亦明顯增加，且在低、中質(zhì)量濃度(1.0和2.0 mg·L-1)時以晚期凋亡為主，高質(zhì)量濃度(4.0 mg·L-1)時以早期凋亡為主。如表3所示，1.0，2.0和4.0 mg·L-1夏枯草處理組的凋亡率分別為12.08%±2.72%，51.88%±4.98%和77.62%±0.94%，明顯高于對照組1.67%±0.21%，且各組間經(jīng)統(tǒng)計，P<0.05，呈現(xiàn)顯著質(zhì)量濃度效應(yīng)依賴關(guān)系。

表3 不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物作用于肺癌A549細(xì)胞24 h后凋亡率的變化

4 討論

肺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，其特點是生長迅速，早期容易全身轉(zhuǎn)移，發(fā)生率和死亡率已占據(jù)常見腫瘤的首位。目前，臨床上多采用化療加放療相結(jié)合的方法進(jìn)行治療，但用此法治療毒副作用大，患者難以堅持。因此，尋找療效好而毒副作用低的藥物是目前腫瘤治療的主要方向之一。

本實驗所用夏枯草干燥果穗來自江蘇老山，且采取了優(yōu)化的乙醇提取工藝，對體外腫瘤細(xì)胞的半數(shù)致死質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)的報道[3-8]，可見其乙醇提取物中的生物活性物質(zhì)含量較高。已有文獻(xiàn)報道，夏枯草中的槲皮素能誘導(dǎo)肝癌、鼻咽癌細(xì)胞的凋亡[10-11]，本實驗中抑制肺癌細(xì)胞A549增殖，誘導(dǎo)其凋亡的活性物質(zhì)，還有待于進(jìn)一步確定。

本實驗結(jié)果還顯示，低質(zhì)量濃度(0.5 mg·L-1)的江蘇夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞就有非常明顯的生長抑制作用，且能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生劑量依賴性地細(xì)胞周期阻滯，此外，隨著夏枯草質(zhì)量濃度的增高，其Sub G1峰比例呈明顯上升趨勢，表明夏枯草乙醇提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。隨著藥物劑量的增加，細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例亦明顯增加，且在低、中質(zhì)量濃度(1.0和2.0 mg·L-1)時以晚期凋亡為主，高質(zhì)量濃度(4.0 mg·L-1)時主要發(fā)生早期凋亡。體外細(xì)胞劃痕實驗觀察結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度(0.5 mg·L-1)的江蘇夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞的遷移能力也有明顯的抑制作用，但由于實驗經(jīng)費(fèi)的限制，未能使用Transwell法進(jìn)行精確定量。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，江蘇夏枯草乙醇提取物在體外可以抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖和遷移作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，從而使細(xì)胞周期失控，導(dǎo)致細(xì)胞增殖停止，發(fā)生細(xì)胞凋亡，且具有明顯的量效和時效關(guān)系。有文獻(xiàn)報道，夏枯草誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的信號通路可能是通過下調(diào)Bc1-2蛋白、上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)實現(xiàn)的[12-13]。江蘇夏枯草乙醇提取物誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡的信號通路，以及其能否抑制肺癌細(xì)胞體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移，還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 顧曉潔，李友賓，李萍，等.夏枯草花穗化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2007，32(10): 923-926.

[2] Cheung H Y，Zhang Q F.Enhanced analysis of triterpenes， flavonoids and phenolic compounds inPrunellavulgarisL. by capillary zone electrophoresis with the addition of running buffer modifiers[J]. J Chromatogr A， 2008， 12(13): 231-238.

[3] 孟歌，張可杰，張明智.夏枯草的化學(xué)成分和抗癌活性研究[J].西北藥學(xué)雜志， 2007，22(4): 211-213.

[4] Harput U S， Saracoglu I， Ogihara Y. Effects of twoPrunellaspecies on lymphocyte roliferation and nitric oxide production[J]. Phytother Res，2006，20(1): 157-159.

[5] 付曉瑞，孫振昌，張明智．夏枯草提取物誘導(dǎo)B、T淋巴瘤細(xì)胞凋亡的實驗研究[J]．中藥材，2012，35(3): 433-438.

[6] 陳暢輝，付強(qiáng)，雷彥剛．中藥夏枯草對結(jié)腸癌細(xì)胞FasL基因表達(dá)和侵襲能力的影響[J]． 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(6): 1034-1037.

[7] 宋瑋，張炳太，萬云杰，等．夏枯草注射液對胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡的影響及機(jī)制研究[J]．中外醫(yī)療，2012，24(3): 26-28.

[8] 張靜，黃晶，張婧，等．中藥夏枯草對人膀胱癌細(xì)胞FasL基因表達(dá)和侵襲能力的影響[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10(14): 2628-2631.

[9] 裴慧，錢士輝．夏枯草中2個三萜類化合物的體外抗腫瘤活性研究[J]．海峽藥學(xué)，2011，23(3): 43-45.

[10]李安強(qiáng)，郭天康，李榮范，等．反義抑制Survivin表達(dá)對槲皮素誘導(dǎo)肝癌SSMC-7721細(xì)胞凋亡的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29(3): 227-230.

[11]張峰，崔永華，曹平．槲皮素對人鼻咽癌HEN1細(xì)胞系增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007，21(24): 1136-1139.

[12]鄭學(xué)芝，鄭學(xué)海，李佳，等．夏枯草提取物對人食管癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國食物與營養(yǎng)， 2012，18(9): 74-76.

[13]宋瑋，張炳太，萬云杰，等．夏枯草注射液對胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡的影響及機(jī)制研究[J].中外醫(yī)療， 2012，24(7): 26-28.