朱勁華,賈曉斌,張 威*(.江蘇建康職業(yè)學(xué)院,南京 009;.江蘇省中醫(yī)藥研究院,南京 0097)
隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重,肺癌的發(fā)生率和死亡率也急劇上升,成為人類健康的頭號殺手。目前,對肺癌最常用的保守治療方式還是放、化療,由于存在嚴(yán)重的耐藥性和機(jī)體損傷,療效甚微。而抗腫瘤中藥不易產(chǎn)生耐藥性,對機(jī)體的損傷較小。因此,從傳統(tǒng)中藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物具有非常重要的意義。
夏枯草為唇形科植物夏枯草(PrunellavulgarisL.)的干燥果穗,含有多種藥理活性成分,主要包括萜類及其皂苷類、黃酮類、香豆素類、有機(jī)酸類、苯丙素類、揮發(fā)油、糖類等成分,具有清火、明目、散結(jié)、消腫之功效[1-2]?,F(xiàn)代臨床和藥理研究表明,夏枯草具有廣泛的抗腫瘤作用[3],能抑制淋巴瘤[4-5]、結(jié)腸癌[6]、胰腺癌[7]、膀胱癌[8]、肺癌[9]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖。但關(guān)于夏枯草是如何誘發(fā)肺癌細(xì)胞凋亡的,能否抑制肺癌細(xì)胞的遷移,作者未見有相關(guān)報道。本研究選用江蘇地產(chǎn)夏枯草的干燥果穗為實驗材料,制備其乙醇提取物,以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為靶細(xì)胞,研究夏枯草乙醇提取物對肺癌細(xì)胞體外生長、遷移、細(xì)胞周期及凋亡的影響,旨在探討江蘇地產(chǎn)夏枯草乙醇提取物在肺癌臨床治療中的藥物價值,并為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供依據(jù)。
1.1儀器 索氏提取儀(上海啟前電子科技有限公司);BUCHI Rotavapor R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士);DZF-6051型真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);倒置顯微鏡(Olympus,日本);酶標(biāo)儀(Bio-TEK,美國); FACScaliber流式細(xì)胞儀(BD Biosciences, 美國)。
1.2材料 江蘇地產(chǎn)夏枯草(Spicaprunellae,購于山農(nóng),經(jīng)鑒定);人類肺癌細(xì)胞株A549源自ATCC (美國模式培養(yǎng)物集存庫),由本實驗室保存和培養(yǎng);細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(Hyclone, 美國);胎牛血清(Hyclone, 美國);Annexin-V FITC和PI雙染試劑盒(Invitrogen,美國)。
2.1夏枯草乙醇提取物的制備 取夏枯草500 g,分批加10倍量的乙醇回流提取2次,每次2 h,過濾;殘渣再用10倍量的體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇回流提取2次,每次2 h,過濾;合并濾液并濃縮成浸膏, 60 ℃減壓干燥,并制成凍干粉。將藥物粉末溶于無水乙醇中,配成母液質(zhì)量濃度為5 g·L-1,并于4 ℃冰箱中避光保存。使用時,按照梯度稀釋法用相應(yīng)的完全培養(yǎng)基稀釋成所需質(zhì)量濃度,現(xiàn)配現(xiàn)用。
2.2腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) A549腫瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)基為DMEM(含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清,100 mg·L-1鏈霉素,100 u·mL-1青霉素),置于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
2.3MTT法檢測腫瘤細(xì)胞的存活率 取對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞(稀釋為8×103個·mL-1),按每孔100 μL接種到96孔培養(yǎng)板中,設(shè)置空白組、對照組和9組含不同質(zhì)量濃度的夏枯草的實驗組(夏枯草的終質(zhì)量濃度分別為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5和5.0 mg·L-1),每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)12,24和48 h,分別用MTT法檢測每孔的吸光度(A值)。按下式計算細(xì)胞在不同夏枯草質(zhì)量濃度作用下的存活率。
細(xì)胞存活率=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%
2.4細(xì)胞克隆形成實驗 將不同質(zhì)量濃度夏枯草(終質(zhì)量濃度分別為1.0,2.0和4.0 mg·L-1)處理24 h的貼壁細(xì)胞計數(shù)后,分別接種至60 mm培養(yǎng)皿中,每組設(shè)3個平行樣,并繼續(xù)培養(yǎng)2~3周。待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的小克隆點時終止培養(yǎng),棄上清,用PBS洗滌2次,加入甲醇3 mL,固定30 min,去固定液,加入3 mL Giemsa染色應(yīng)用液染色30 min,洗去染色液,空氣干燥。在顯微鏡下計數(shù)大于或等于50個細(xì)胞的克隆數(shù),計算各劑量組的克隆形成率(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)以及存活率。
細(xì)胞存活率=(某劑量的克隆形成率/該劑量下種植的細(xì)胞數(shù)×對照組克隆形成率)×100%。
2.5倒置顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)的變化 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞(8×103個·mL-1)100 μL接種到96孔培養(yǎng)板中,設(shè)空白對照組(加100 μL培養(yǎng)液)和不同質(zhì)量濃度的夏枯草實驗組(終質(zhì)量濃度分別為1.5,3.0和4.0 mg·L-1)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h時,利用倒置顯微鏡觀察并拍照。
2.6細(xì)胞劃痕實驗觀察A549細(xì)胞遷移能力的變化 將細(xì)胞密度為5×105個·mL-1的A549細(xì)胞鋪于24孔板(每孔500 μL)上,加入含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng),使形成單層細(xì)胞。用10 μL移液槍槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕,用PBS清洗3次,設(shè)空白對照組(加100 μLPBS)和夏枯草不同質(zhì)量濃度的實驗組(終質(zhì)量濃度分別為0.5和1.0 mg·L-1),孵育24 h,換成含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的培養(yǎng)液,孵育24和48 h,用PBS清洗3次,在倒置顯微鏡下觀察并拍照。
2.7流式細(xì)胞分析法檢測細(xì)胞周期的變化 將對數(shù)生長期細(xì)胞以每孔2×105個的密度接種至6孔板中,每孔2 mL,培養(yǎng)24 h后,實驗組用不同質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物(終質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0和1.5 mg·L-1)處理24 h,對照組不加藥。離心收集懸浮細(xì)胞,用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇固定4 h,PBS洗滌2次。將細(xì)胞重懸于500 μL含300 μg·mL-1RNA酶的溴化丙啶(PI,10 μg·mL-1)溶液中,于冰上放置30 min,過濾,用FACSCaliber流式細(xì)胞儀和ModFit LTTM軟件對每份樣品的10 000個細(xì)胞的細(xì)胞周期分布進(jìn)行計算。
2.8夏枯草誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分析 使用Annexin-V FITC和PI雙染試劑盒分析夏枯草誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。使用不同質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物(終質(zhì)量濃度分別為0,25和50 mg·L-1)孵育A549細(xì)胞48 h,用含有EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。再用預(yù)冷的PBS洗滌后,每管加入1×binding buffer重懸細(xì)胞。用多聚甲醛固定,每管加入5 μL Annexin-V FITC和500 μL PI,混勻,避光孵育15 min。以400 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,美國)檢測。
3.1夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞的生長抑制作用 見圖1。結(jié)果表明,夏枯草乙醇提取物對A549細(xì)胞生長抑制作用明顯,不同質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物對人肺癌A549細(xì)胞均有抑制作用,并隨著藥物劑量的增加,其抑制作用越明顯;同時,夏枯草乙醇提取物處理的時間越長,其細(xì)胞抑制作用也越明顯。夏枯草乙醇提取物抑制A549細(xì)胞生長的半數(shù)致死質(zhì)量濃度,即IC50,分別約為4.3(12 h),3.6(24 h)和3.0 mg·L-1(48 h)。
圖1 MTT法檢測的夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用
細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果亦證實:一定質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物能顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力,且1.0,2.0和4.0 mg·L-1夏枯草乙醇提取物處理組的細(xì)胞存活率分別為66.37%±1.30%,1.49%±0.03%和0。
由以上實驗結(jié)果可知,夏枯草乙醇提取物具有明顯的體外抗腫瘤作用,可明顯抑制肺癌細(xì)胞的生長和增殖,且有顯著的量效和時效關(guān)系。
3.2夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞形態(tài)和生長密度的影響 見圖2。由圖2可知,與對照組相比,夏枯草乙醇提取物作用24 h后,A549的生長受到明顯的抑制,且隨著質(zhì)量濃度的增加,抑制作用愈明顯。具體表現(xiàn)為:終質(zhì)量濃度為1.5,3.0和4.0 mg·L-1的夏枯草乙醇提取物對A549的生長有明顯的抑制作用,終質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1夏枯草乙醇提取物作用24 h后,與對照組相比,細(xì)胞密度明顯減小,形態(tài)變化不明顯;終質(zhì)量度為3.0 mg·L-1夏枯草乙醇提取物作用24 h后,與對照組相比,細(xì)胞密度減小得更加明顯,從形態(tài)上看大部分細(xì)胞變圓。終質(zhì)量濃度為4.0 mg·L-1夏枯草乙醇提取物作用24 h后,與對照組相比,細(xì)胞密度減小得最為明顯,從形態(tài)上看絕大部分細(xì)胞變圓。
圖2 不同質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞形態(tài)和生長密度的影響
3.3夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞體外遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果如圖3顯示,0.5和1.0 mg·L-12種質(zhì)量濃度的夏枯草乙醇提取物都能抑制肺癌A549細(xì)胞的體外遷移能力,且時間越長,抑制作用越明顯。
圖3 不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞體外遷移能力的影響
3.4夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞周期的影響 為了進(jìn)一步了解夏枯草乙醇提取物抑制肺癌細(xì)胞A549生長的作用機(jī)制,本實驗還通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測,以觀察不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物對肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期的影響。
如表1結(jié)果所示,0.5 mg·L-1夏枯草乙醇提取物處理A549細(xì)胞24 h后,其G0/G1期細(xì)胞比例相比對照組有所增加,且這種改變經(jīng)t檢驗分析,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而G2/M期及S期細(xì)胞比例雖較對照組,均有所下降,但經(jīng)t檢驗分析后,P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。1.5 mg·L-1夏枯草處理組,與對照組和1 mg·L-1夏枯草處理組相比,其G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升,G2/M期細(xì)胞比例亦上升,同時伴隨著S期細(xì)胞比例明顯下降。以上結(jié)果表明,夏枯草乙醇提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G0/G1期或G2/M期細(xì)胞周期阻滯,其中低質(zhì)量濃度(0.5 mg·L-1)表現(xiàn)為G0/G1期阻滯,中、高質(zhì)量濃度(1和1.5 mg·L-1)時,隨著夏枯草質(zhì)量濃度的增高,其G0/G1期和G2/M期細(xì)胞阻滯愈明顯。
表1 不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物作用于肺癌A549細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期的變化
周期阻滯的同時,隨著夏枯草質(zhì)量濃度的增高,其Sub G1峰比例亦呈明顯上升趨勢。如表2所示,0.5,1和1.5 mg·L-1夏枯草處理組的Sub G1峰比例分別為4.49%±0.13%,19.12%±1.78%和70.44%±3.14%,明顯高于對照組(1.60%±0.55%),且各組間經(jīng)統(tǒng)計,P<0.05,表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義,呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。
表2 不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物作用于肺癌A549細(xì)胞Sub G1峰比例的變化
3.5夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響 為進(jìn)一步研究夏枯草乙醇提取物誘發(fā)的肺癌細(xì)胞凋亡過程,遂采用了磷脂酰絲氨酸外翻法進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。Annexin V/PI雙染法將細(xì)胞分成4種屬性,其中Ⅰ象限(Annexin V-/PI+)為壞死細(xì)胞象限;Ⅱ象限(Annexin V+/PI+)為晚期凋亡細(xì)胞;Ⅲ象限(Annexin V-/PI-)為正常細(xì)胞象限;Ⅳ象限(Annexin V+/PI-)為早期凋亡象限。
通過檢測發(fā)現(xiàn),不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物(1.0,2.0和4.0 mg·L-1)作用A549細(xì)胞24 h,可誘導(dǎo)劑量依賴性地細(xì)胞凋亡,即隨著藥物劑量的增加,細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例亦明顯增加,且在低、中質(zhì)量濃度(1.0和2.0 mg·L-1)時以晚期凋亡為主,高質(zhì)量濃度(4.0 mg·L-1)時以早期凋亡為主。如表3所示,1.0,2.0和4.0 mg·L-1夏枯草處理組的凋亡率分別為12.08%±2.72%,51.88%±4.98%和77.62%±0.94%,明顯高于對照組1.67%±0.21%,且各組間經(jīng)統(tǒng)計,P<0.05,呈現(xiàn)顯著質(zhì)量濃度效應(yīng)依賴關(guān)系。
表3 不同質(zhì)量濃度夏枯草乙醇提取物作用于肺癌A549細(xì)胞24 h后凋亡率的變化
肺癌是一種惡性程度很高的腫瘤,其特點是生長迅速,早期容易全身轉(zhuǎn)移,發(fā)生率和死亡率已占據(jù)常見腫瘤的首位。目前,臨床上多采用化療加放療相結(jié)合的方法進(jìn)行治療,但用此法治療毒副作用大,患者難以堅持。因此,尋找療效好而毒副作用低的藥物是目前腫瘤治療的主要方向之一。
本實驗所用夏枯草干燥果穗來自江蘇老山,且采取了優(yōu)化的乙醇提取工藝,對體外腫瘤細(xì)胞的半數(shù)致死質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)的報道[3-8],可見其乙醇提取物中的生物活性物質(zhì)含量較高。已有文獻(xiàn)報道,夏枯草中的槲皮素能誘導(dǎo)肝癌、鼻咽癌細(xì)胞的凋亡[10-11],本實驗中抑制肺癌細(xì)胞A549增殖,誘導(dǎo)其凋亡的活性物質(zhì),還有待于進(jìn)一步確定。
本實驗結(jié)果還顯示,低質(zhì)量濃度(0.5 mg·L-1)的江蘇夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞就有非常明顯的生長抑制作用,且能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生劑量依賴性地細(xì)胞周期阻滯,此外,隨著夏枯草質(zhì)量濃度的增高,其Sub G1峰比例呈明顯上升趨勢,表明夏枯草乙醇提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。隨著藥物劑量的增加,細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例亦明顯增加,且在低、中質(zhì)量濃度(1.0和2.0 mg·L-1)時以晚期凋亡為主,高質(zhì)量濃度(4.0 mg·L-1)時主要發(fā)生早期凋亡。體外細(xì)胞劃痕實驗觀察結(jié)果顯示,低質(zhì)量濃度(0.5 mg·L-1)的江蘇夏枯草乙醇提取物對肺癌A549細(xì)胞的遷移能力也有明顯的抑制作用,但由于實驗經(jīng)費(fèi)的限制,未能使用Transwell法進(jìn)行精確定量。
綜上所述,本研究結(jié)果顯示,江蘇夏枯草乙醇提取物在體外可以抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖和遷移作用,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯,從而使細(xì)胞周期失控,導(dǎo)致細(xì)胞增殖停止,發(fā)生細(xì)胞凋亡,且具有明顯的量效和時效關(guān)系。有文獻(xiàn)報道,夏枯草誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的信號通路可能是通過下調(diào)Bc1-2蛋白、上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)實現(xiàn)的[12-13]。江蘇夏枯草乙醇提取物誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡的信號通路,以及其能否抑制肺癌細(xì)胞體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移,還有待于進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn):
[1] 顧曉潔,李友賓,李萍,等.夏枯草花穗化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志,2007,32(10): 923-926.
[2] Cheung H Y,Zhang Q F.Enhanced analysis of triterpenes, flavonoids and phenolic compounds inPrunellavulgarisL. by capillary zone electrophoresis with the addition of running buffer modifiers[J]. J Chromatogr A, 2008, 12(13): 231-238.
[3] 孟歌,張可杰,張明智.夏枯草的化學(xué)成分和抗癌活性研究[J].西北藥學(xué)雜志, 2007,22(4): 211-213.
[4] Harput U S, Saracoglu I, Ogihara Y. Effects of twoPrunellaspecies on lymphocyte roliferation and nitric oxide production[J]. Phytother Res,2006,20(1): 157-159.
[5] 付曉瑞,孫振昌,張明智.夏枯草提取物誘導(dǎo)B、T淋巴瘤細(xì)胞凋亡的實驗研究[J].中藥材,2012,35(3): 433-438.
[6] 陳暢輝,付強(qiáng),雷彥剛.中藥夏枯草對結(jié)腸癌細(xì)胞FasL基因表達(dá)和侵襲能力的影響[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009,17(6): 1034-1037.
[7] 宋瑋,張炳太,萬云杰,等.夏枯草注射液對胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡的影響及機(jī)制研究[J].中外醫(yī)療,2012,24(3): 26-28.
[8] 張靜,黃晶,張婧,等.中藥夏枯草對人膀胱癌細(xì)胞FasL基因表達(dá)和侵襲能力的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,10(14): 2628-2631.
[9] 裴慧,錢士輝.夏枯草中2個三萜類化合物的體外抗腫瘤活性研究[J].海峽藥學(xué),2011,23(3): 43-45.
[10]李安強(qiáng),郭天康,李榮范,等.反義抑制Survivin表達(dá)對槲皮素誘導(dǎo)肝癌SSMC-7721細(xì)胞凋亡的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2008,29(3): 227-230.
[11]張峰,崔永華,曹平.槲皮素對人鼻咽癌HEN1細(xì)胞系增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,21(24): 1136-1139.
[12]鄭學(xué)芝,鄭學(xué)海,李佳,等.夏枯草提取物對人食管癌Eca-109細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國食物與營養(yǎng), 2012,18(9): 74-76.
[13]宋瑋,張炳太,萬云杰,等.夏枯草注射液對胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡的影響及機(jī)制研究[J].中外醫(yī)療, 2012,24(7): 26-28.