肖會敏，何 悅，黨 珍，謝艷華，王四旺(第四軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心，西安 710032)

參花膠囊由紅花、丹參、菊花等中藥組成，主要用于活血化瘀、行氣止痛等。處方中主要活性成分有：丹參中的丹參酮類、丹酚酸類[1-3]，川芎中的川芎嗪、阿魏酸等[4]，紅花中的紅花黃色素、羥基紅花黃色素A等[5-6]，赤芍中的單萜及單萜苷類化合物、苷類等[7]，菊花中的黃酮類化合物和綠原酸等[8]，山楂中的黃酮類、黃烷及其聚合物類、三萜類和有機酸類等[9]，甘草主要活性成分含有多種黃酮類化合物、三萜類化合物以及香豆素類、氨基酸、多種生物堿和多種有機酸等[10-11]。本處方采用醇提與水提等工藝制成。為表征本處方中的主要活性成分，作者采用高效液相色譜(HPLC)法對該制劑進行分析，參照文獻方法[12]進行實驗；同時，對參花膠囊中的4種成分即綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B進行定量分析。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津高效液相色譜儀，型號Prominence UFLC，配LC-20AD雙泵，SPD-M20A二極管陣列檢測器，SIL-20ACHT自動進樣器，CTO-20A柱溫箱，LC/Labsoluion色譜工作站(日本島津公司)；BSA124S電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ-300DE數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 乙腈、甲醇，色譜級(美國Fish公司)；超純水，由美國Millipore純水儀制備(美國millipore公司)；丹酚酸B、迷迭香酸、綠原酸、羥基紅花黃色素A對照品均購自中國藥品生物制品檢定研究院；參花膠囊(批號20090908，20090918，20090928，20130601，20130602，20130603，20130604，20130605，20130606，20130607)，第四軍醫(yī)大學藥物研究所研制。

2 指紋圖譜測定方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-5.0 g·L-1磷酸水溶液溶液(B)，梯度洗脫：0～15 min，A 5%→21%；15～40 min，A 21%→40%；40～65 min，A40%→100%；65～70 min，A100%。記錄時間為70 min 。體積流量：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量5 μL。

2.2供試品與參比物溶液的制備

2.2.1參比物溶液的制備 精密稱取迷迭香酸對照品5.0 mg，置于50 mL量瓶中，加體積分數(shù)70%甲醇至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的參比物溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取10粒本品內(nèi)容物，混勻，稱取0.5 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇適量，超聲30 min，放冷，加體積分數(shù)70%甲醇至刻度，濾過(0.45 μm濾膜)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3方法學考察

2.3.1精密度實驗 取供試品溶液(批號20090908)，連續(xù)進樣6次，分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行分析。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值分別小于0.5%和2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液(批號20090908)，分別于各時間點即0，2，4，8，12和24 h進樣，分析共有峰的相對保留時間、相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD值分別小于1.0%和2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復性實驗 取6份樣品(批號20090908)，分別按供試品溶液的制備與色譜條件進行分析，分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行分析。結(jié)果，各共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值分別小于0.5%和2.0%，表明重復性良好。

2.3.4指紋圖譜的建立及相似度評價 取10批樣品，分別按上述供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，進樣，得色譜圖(圖1)，峰17為迷迭香酸即參比物，按上述色譜條件進行分析，建立指紋圖譜。10批樣品共有色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD值均分別小于0.5%和2.0%，符合文獻[10]要求，見圖1和圖2。運用文獻[10]要求對各批樣品的指紋圖譜進行相似度分析，對選定39個共有色譜峰進行譜峰匹配，通過計算得出樣品指紋圖譜的共有模式，并以此共有模式為標準，進行整體相似度評價，結(jié)果相似度為0.966～0.998，表明這各批樣品的化學成分一致性較好。

圖1 參花膠囊HPLC指紋圖譜

圖2 10批參花膠囊的HPLC指紋圖譜

3 含量測定方法與結(jié)果

3.1色譜條件 檢測波長為320 nm，其余同2.1項。

3.2對照品溶液的配制 分別精密稱取綠原酸對照品2.2 mg、迷迭香酸3.8 mg、羥基紅花色素A12.3 mg、丹酚酸B17.1 mg，置于10 mL量瓶中，加體積分數(shù)70%甲醇至刻度，作為儲備液。

3.3供試品溶液的制備 同2.2.2項。

3.4線性關(guān)系 分別精密量取儲備液0.031，0.062，0.125，0.250和0.500 mL對照品溶液，分別置于1 mL量瓶中，并加體積分數(shù)70%甲醇稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣。以各對照品的質(zhì)量濃度(x，μg·mL-1)為橫坐標、峰面積值(y)為縱坐標，通過計算，得線性方程，結(jié)果見表1，表明各對照品在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.5精密度實驗 精密吸取上述線性對照品溶液(0.125 mL儲備液加體積分數(shù)70%甲醇定容至1 mL)，重復進樣5次，測得綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B的相對標準差(RSD)分別為1.05%，1.07%，1.25%，1.09%和1.36%，表明儀器具有良好的精密度。

表1 對照品的線性方程及其質(zhì)量濃度范圍

3.6重復性實驗 精密稱取5份樣品(批號20090908)，分別按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按3.3項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B平均含量分別為0.55，3.20，0.99和8.50 mg·g-1，RSD值分別為1.33%，1.05%，1.15%和1.42%，表明該方法具有良好重復性。

3.7穩(wěn)定性實驗 精密吸取對照品溶液(0.125 mL儲備液，加體積分數(shù)70%甲醇定容至1 mL)，在第0，2，4，8，12和24 h進樣。結(jié)果，綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面積的RSD值分別為1.08%，1.14%，1.19%和1.33%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8加樣回收率實驗 取參花膠囊(批號20090908，其中綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、丹酚酸B分別為0.55，3.20，0.99和8.50 mg·g-1)10粒內(nèi)容物，混勻，稱取粉末0.5 g，精密稱定，分別添加混合對照品溶液(分別精密稱取綠原酸對照品1.0 mg、迷迭香2.5 mg、羥基紅花色素A 8.0 mg，丹酚酸B 8.4 mg，置于5 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度)0.25 mL或0.50 mL或1.00 mL，按照2.2.3項下方法制備供試品溶液，共制備6份樣品，按照3.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見表2，表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率測定結(jié)果

表2(續(xù)) 加樣回收率測定結(jié)果

3.9含量測定 精密稱取10批樣品，分別按照2.2.2項下方法制備供試品，按照3.1項下色譜條件測定。各批樣品中綠原酸、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸 、丹酚酸B的平均含量分別為0.54，3.22，0.99和8.52 mg·g-1，RSD分別為1.37%，0.77%，1.40%和0.44%。

4 分析與討論

中藥尤其是復方中藥，其功效是建立在多種復雜化學成分共同作用基礎(chǔ)之上的，不能簡單地以一種或幾種成分來評價中藥的有效性和專屬性。中藥的有效成分多數(shù)是次生代謝物，它們有很大的差異，同時具有一定的共性，很多成分出現(xiàn)在多種藥材中，這對中藥材的真?zhèn)舞b定和質(zhì)量控制帶來很大的難度。而中藥指紋圖譜是把中藥材、中藥制劑等作為研究對象，運用現(xiàn)代科學分析技術(shù)，找到能夠表征其化學特征的色譜圖或光譜圖等數(shù)據(jù)；它是一種綜合的、可量化的分析鑒定方法，是建立在中藥復雜的化學成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價中藥材、中藥制劑、半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性；它的顯著特點是“整體性”和“模糊性”[13]。因此，對具有良好重復性的指紋圖譜，用于中藥材與中藥制劑的質(zhì)量控制，將對中藥走向現(xiàn)代化和國際化具有重要意義。

采用全波長對參花膠囊樣品進行測定，依據(jù)三維色譜圖及對應(yīng)波長下峰的信息量，結(jié)果254 nm時信息量較大，故將其作為HPLC指紋圖譜的定性波長。測定4種化合物含量檢測波長的選擇，根據(jù)二極管陣列對綠原酸、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B、迷迭香酸掃描，結(jié)果最大吸收分別在326，403，286和329 nm，同時依據(jù)各峰的面積值與分離度(≥1.5)，檢測波長選擇320 nm，各峰信息較為理想。

由于中藥復方中成分眾多，各成分溶解性不一樣，等度洗脫難以充分洗脫，所以采用梯度洗脫的方法。選用Kromasil C18(250 mm×4. 6 mm，5 μm)色譜柱，采用梯度洗脫方法，比較了不同流動相系統(tǒng)乙腈-磷酸水溶液、甲醇-水、乙腈-醋酸水溶液、乙腈-水?？疾炝肆姿崴芤翰煌|(zhì)量濃度(2.0，5.0，8.0和10.0 g·L-1)。結(jié)果表明，乙腈-5.0 g·L-1磷酸水溶液系統(tǒng)優(yōu)于其他流動相系統(tǒng)，故選乙腈-5.0 g·L-1磷酸水溶液流動相系統(tǒng)作為本制劑指紋圖譜流動相系統(tǒng)。

對制樣方法進行了比較，采用甲醇與水超聲提取，比較了甲醇的不同體積分數(shù)(20%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%)、不同提取方法(超聲、加熱回流、浸漬等)、不同超聲時間(5，10，15，20，30，40，50和60 min)。對不同溶劑比較，結(jié)果表明，甲醇優(yōu)于水；對不同提取方法比較，結(jié)果表明，超聲提取出峰多、峰面積大、時間短；對不同超聲時間比較，結(jié)果表明，甲醇超聲30 min以后，各個峰的面積不增加。綜合上述各因素，選擇70%甲醇、超聲30 min，所得指紋峰較理想。

對不同柱溫與流速進行比較，柱溫超過或低于30 ℃，但大部分色譜峰分離度小或不能分開；流速高于或低于0.8 mL·min-1，大部分色譜峰分離度差。因此，選擇便于控制的柱溫30 ℃與流速0.8 mL·min-1。

綜上所述，通過對10批次的參花膠囊樣品進行相似度計算，結(jié)果數(shù)值介于0.966～0.998。同時，4種化合物定量結(jié)果，含量均一穩(wěn)定，表明建立的參花膠囊的HPLC指紋圖譜方法與含量測定方法，具有良好的分析評價能力，具有簡便、穩(wěn)定、可靠、準確等明顯優(yōu)勢，因此，均可用于該制劑的質(zhì)量控制。

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