宋小妹，許苗苗，劉銀環(huán)，王 薇，劉 超，楊新杰，崔九成(陜西中醫(yī)學(xué)院，咸陽 712046)

珠子參為五加科人參屬植物珠子參PanaxjaponicusC.A. Mey. var.major(Burk.) C.Y. Wu et K.M. Feng或羽葉三七PanaxjaponicusC.A. Mey. var.bipinnatifidus(Seem.) C.Y. Wu et K.M. Feng的干燥根莖，常用于治療氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、跌撲損傷、關(guān)節(jié)疼痛、咳血、外傷出血等癥[1]。珠子參也是民間習(xí)用特色中藥材太白七藥之一，分布于我國陜西、四川、云南、甘肅、貴州等地。目前對珠子參的研究主要集中在生藥、化學(xué)、藥效[2-7]等方面，而在植物分子生物學(xué)研究方面的報道甚少；而珠子參由于受其生長環(huán)境等因素及人為過度采挖而被列為瀕危藥用植物。因此，開展珠子參的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)多樣性方面的研究，對珠子參種質(zhì)資源保護及資源的開發(fā)利用都將產(chǎn)生重要影響。

簡單重復(fù)序列間區(qū)多態(tài)性標(biāo)記(ISSR)是Zietkiewicz等[8]于1994年提出的一種基于微衛(wèi)星(SSR)的十分有效的分子標(biāo)記，具有多態(tài)性高、產(chǎn)率中等、重復(fù)性好、操作簡單、引物開發(fā)無需任何DNA序列信息等優(yōu)點，在不同的物種間具有通用性，比較適合于基因組未測序已知DNA序列信息量小的物種使用。目前，ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定評價、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀標(biāo)記、進化及分子生態(tài)學(xué)等研究中[9]。本實驗旨在探索珠子參基因組DNA最優(yōu)提取方法，建立和優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系，為珠子參的分子鑒別提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器 CT 9612型基因擴增儀(杭州柏恒科技有限公司)；DYY-10C型電泳儀(北京六一儀器廠)；UV-1800紫外檢測器(日本島津公司)；S.M-76S型凝膠成像系統(tǒng)(意大利BIO-RAD Lab公司)；3-18K型臺式冷凍離心機(德國Sigma公司)。

1.2試藥

1.2.1植物材料 23份樣品(1,2及12～14號為新鮮根莖，其余均為新鮮葉片)分別采自陜西、四川、云南3個主產(chǎn)區(qū)的10個不同地區(qū)，保存于-80℃超低溫冰箱中備用。所有樣本均經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館王繼濤高級實驗師鑒定，其中，除10號樣本為羽葉三七PanaxjaponicusC.A. Mey. var.bipinnatifidus(Seem.) C.Y. Wu et K.M. Feng外，其余樣本均為珠子參PanaxjaponicusC.A. Mey. var.major(Burk.) C.Y. Wu et K.M. Feng。

1.2.2試劑及引物 10×PCR Buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker、新型植物基因組DNA提取試劑盒(nuclean plantgen DNA kit)均購自北京康為世紀生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純。所用ISSR引物參照加拿大的不列顛哥倫比亞大學(xué)所公布的序列，由上海生物工程有限公司合成。

2 實驗方法

2.1基因組DNA的提取及檢測 采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(nuclean plantgen DNA kit)，具體操作步驟如下：

取植物新鮮組織100 mg，加入液氮充分研磨。將研磨后的粉末收集到離心管中，加入400 μL Buffer GLP1和6 μL RNase A(10 mg·mL-1)，渦旋振蕩1 min，室溫放置10 min，使其充分裂解。加入130 μL Buffer LP2，混勻，渦旋振蕩1 min。以12 000 r·min-1離心5 min，將上清液移至新的離心管中。加入1.5倍體積的Buffer LP3充分混勻。將上步所得溶液和沉淀全部加入到已裝入收集管的吸附柱中。以12 000 r·min-1離心1 min，棄去收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入500 μL Buffer GW(使用前加無水乙醇)，以12 000 r·min-1離心1 min，棄去收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。以12 000 r·min-1離心2 min，棄去收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，徹底晾干。將吸附柱重新放到一個新的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～100 μL Buffer GE或滅菌水，室溫放置3 min，以12 000 r·min-1離心1 min，收集DNA溶液。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用18 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳以DL2000為標(biāo)準檢測DNA完整性，在紫外分光光度計上，根據(jù)A260/A280確定DNA的質(zhì)量和濃度。將檢驗合格的所有供試DNA樣品儲存在-20 ℃冰箱中，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2ISSR-PCR擴增條件優(yōu)化 在前期查閱資料[10-14]及預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，認為影響ISSR-PCR反應(yīng)的主要因素為：dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA濃度等，因此，采用L16(45)正交設(shè)計對影響ISSR-PCR反應(yīng)的主要因素進行優(yōu)化。影響因素水平見表1，實驗設(shè)計方案見表2。

PCR總反應(yīng)液體積除表1中所列外，還包括2 μL 10×PCR Buffer，用去離子水補足到20 μL。擴增引物采用通用引物UBC818，樣品采用陜西太白縣太白山山神廟珠子參葉DNA。

表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交實驗因素水平表

表2 ISSR反應(yīng)體系L16(45)正交實驗設(shè)計

初步設(shè)定的ISSR-PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 min；72 ℃延伸1 min；循環(huán)40次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL擴增產(chǎn)物采用18 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，置于紫外凝膠成像分析儀中觀察拍照。

2.3ISSR-PCR擴增 按照優(yōu)選出的反應(yīng)體系采用UBC 818對23個DNA樣品全部進行ISSR-PCR擴增。

3 結(jié)果與分析

3.1基因組DNA檢測結(jié)果 在紫外分光光度計上測定DNA的A260與A280比值在1.8～2.0之間，電泳條帶集中整齊、清晰明亮、無拖尾、無彌散，表明滿足ISSR反應(yīng)對DNA質(zhì)量的要求。電泳結(jié)果見圖1。

圖1 珠子參基因組DNA

3.2正交實驗結(jié)果和分析及引物篩選 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，依據(jù)所顯示的條帶清晰度及條帶數(shù)量等指標(biāo)進行直觀分析，14號條帶擴增效果較好，即對應(yīng)的表2中14號正交實驗結(jié)果較好。因此最終優(yōu)化出最佳反應(yīng)體系為：20 μL的PCR反應(yīng)體系中含2 μL 10×PCR Buffer、10 ng模板DNA、0.25 mmol· L-1dNTPs、2 μmol·L-1引物、4 U TaqDNA聚合酶、2 mmol·L-1Mg2+。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

圖2 正交實驗ISSR-PCR反應(yīng)體系擴增電泳圖

3.3ISSR-PCR擴增結(jié)果 采用UBC 818對所有樣本進行擴增的結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，此反應(yīng)體系可以給出清晰的指紋圖譜，而且，ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，可用于珠子參的分子的鑒別和遺傳關(guān)系分析。

圖3 樣品的ISSR引物UBC818擴增譜帶

4 討論

珠子參所含皂苷類、多糖類等成分含量較高，在DNA提取過程中易與DNA共沉淀，形成黏稠的膠狀物，難以溶解或產(chǎn)生褐變[15]。本實驗珠子參DNA基因組的提取采用了新型的提取試劑盒，不僅提取步驟簡便、效果好，而且獲得的DNA樣本純度高、雜質(zhì)少，特別適合于從野外采集樣品DNA基因組的快速、高效提取。

影響ISSR-PCR擴增的因素很多?；谡辉O(shè)計具有均衡分散、效應(yīng)明確、綜合可比、信息量大等優(yōu)點，本研究采用5因素4水平正交實驗確定了影響珠子參ISSR-PCR的引物濃度、模板濃度、Taq DNA聚合酶濃度、dNTP濃度、Mg2+濃度的最佳組合，篩選出了擴增條帶清晰、多態(tài)性豐富的ISSR引物13個，建立了穩(wěn)定的、可重復(fù)的珠子參ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系及PCR擴增參數(shù)。本研究主要應(yīng)用引物UBC818進行擴增，優(yōu)選出的條件基本適用于其他大多數(shù)引物，但是在具體使用的過程中還要根據(jù)不同引物的特征進行適當(dāng)?shù)奈⒄{(diào)，主要調(diào)整擴增過程中的退火溫度，以期達到最好的擴增效果。

從圖2和圖3可以看出，樣品10與其他樣品DNA間差異較大。從來源得知，10號樣品為羽葉三七，雖然與珠子參同為竹節(jié)參的變種均作為珠子參藥用，但是從分子水平角度初步說明二者間有一定差異。

目前對珠子參從DNA層面展開的研究較少，前人對珠子參的ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)研究很少，很多東西無從借鑒，這就為珠子參的更深入的研究帶來一定的難度。本研究針對珠子參ISSR-PCR反應(yīng)體系的研究，為珠子參種質(zhì)資源的保護、遺傳多樣性的研究、藥效成分的體內(nèi)代謝和人工規(guī)?；耘嘀樽訁⒌於艘欢ǖ幕A(chǔ)。

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