牟晉華等

摘要：以4個(gè)福山包頭系列大白菜品種為試材，對(duì)游離小孢子培養(yǎng)和植株再生過(guò)程中的一些重要因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，不同基因型對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)率和成苗率影響較大，平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚在1.28～38.25個(gè)之間；且胚胎發(fā)生能力高的品種，成苗率較高，胚胎發(fā)生能力低的品種，成苗率也較低；培養(yǎng)基中添加0.1～0.3 g/L活性炭能明顯提高小孢子胚誘導(dǎo)率；及時(shí)將成熟的子葉形胚轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上，對(duì)提高成苗率至關(guān)重要；瓊脂濃度為1.0%～2.0%時(shí)，成苗率大大提高。

關(guān)鍵詞：大白菜；游離小孢子；培養(yǎng)；活性炭

中圖分類(lèi)號(hào)：S634.103.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2014）03-0013-04

AbstractThe factors affecting isolated microspore culture and plant regeneration were studied with four Chinese cabbage varieties of ‘Fushanbaotou. The results showed that there were significant differences in embryogenesis ability of microspore and seedling rate among different genotypes. The embryo yield per bud ranged from 1.28 to 38.25. The varieties with higher embryogenesis ability had higher seedling rate， while those with lower embryogenesis ability had lower seedling rate. The addition of 0.1～0.3 g/L active charcoal could increase the induction rate of microspore-derived embryos significantly. Transferring mature cotyledonary embryos to regeneration medium in time was essential to increase plantlet regeneration rate.The solid medium with agar concentration from 1.0% to 2.0% could increase seedling rate obviously.

Key wordsChinese cabbage；Isolated microspore； Culture； Active charcoal

大白菜是原產(chǎn)我國(guó)的一種重要蔬菜作物，在南北方均有廣泛種植[1，2]。目前生產(chǎn)上主要通過(guò)雜交育種獲得新品種，游離小孢子培養(yǎng)由于其自身的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為大白菜育種的重要手段之一[3～9]。自Sato等[10]首次利用大白菜小孢子獲得再生植株以來(lái)，國(guó)內(nèi)各科研機(jī)構(gòu)也陸續(xù)對(duì)大白菜游離小孢子培養(yǎng)的各個(gè)影響因素進(jìn)行了研究[11]，但由于受基因型和其他一些因素的影響，在小孢子胚胎誘導(dǎo)和再生成苗方面仍然很難形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

福山包頭類(lèi)型大白菜是優(yōu)良的地方栽培品種，由于該類(lèi)型大白菜在抗病毒病方面缺陷，使得種植面積逐漸下降，目前生產(chǎn)中使用的包頭類(lèi)型大白菜多為當(dāng)?shù)仄贩N和外來(lái)品種的雜交種。為了加快遺傳改良進(jìn)程，縮短育種周期，對(duì)4個(gè)福山包頭系列大白菜進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，對(duì)影響小孢子胚狀體發(fā)生和植株再生的主要因素進(jìn)行研究，以期建立起完整的培養(yǎng)體系，獲得DH純系。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2010年10月～2013年10月在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院進(jìn)行。供試大白菜品種為‘福山包頭蓮（001）、‘新煙雜3號(hào)（002）、‘奇山秋美（003）、‘金盛秋早（004），由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院蔬菜課題組提供。供試材料于11月下旬育苗，次年2月下旬定植于試驗(yàn)田，3月下旬至4月下旬取花蕾進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1游離小孢子培養(yǎng)大白菜植株現(xiàn)蕾后，于每天上午8∶00～10∶00摘取健壯植株花序，選取長(zhǎng)度為2.0～2.5 mm的花蕾，參考付文婷等[12]的方法進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。

①基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響：取4種試材合適大小的花蕾，按平均每個(gè)培養(yǎng)皿4個(gè)花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

②活性炭對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響：取4種試材合適大小的花蕾，分別用添加有0、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5 g/L活性炭的NLN-13培養(yǎng)基進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

以上每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.2.2小孢子胚再生成苗將培養(yǎng)21 d的子葉形胚狀體接種于B5+6-BA （0.2 mg/L） +IAA （0.02 mg/L）固體培養(yǎng)基上（含3%的蔗糖，pH 5.8），其余參考鄧英等[13]的方法。

①基因型對(duì)小孢子胚成苗的影響：將4種基因型的子葉形胚接種在瓊脂濃度為1.2%的B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

②胚齡對(duì)小孢子胚成苗的影響：以002為試材，分別取培養(yǎng)10、15、20、25、30、35、40 d的子葉形胚接種在瓊脂濃度為1.2%的B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

③瓊脂濃度對(duì)小孢子胚成苗的影響：以002為試材，將培養(yǎng)21 d的子葉形胚分別轉(zhuǎn)至瓊脂濃度為0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和2.0%的B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

以上每處理接種5瓶，每瓶接種3個(gè)胚狀體，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

由表1可以看出，供試的4個(gè)品種都獲得了胚狀體，但小孢子胚胎發(fā)生能力有一定差異。002產(chǎn)胚率最高，平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚38.25個(gè)；001最低，平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚1.28個(gè)；003與004平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚19.17和21.56個(gè)。由此可見(jiàn)，002、003和004胚胎發(fā)生較易，001胚胎發(fā)生較難。

3討論

本試驗(yàn)對(duì)基因型和培養(yǎng)基添加物質(zhì)在影響大白菜小孢子胚胎發(fā)生中的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，基因型對(duì)小孢子產(chǎn)胚率影響較大，本研究中的4個(gè)大白菜品種每花蕾產(chǎn)胚為1.28～38.25個(gè)，高產(chǎn)胚率約為低產(chǎn)胚率的30倍，曹鳴慶[14]與馬燕[15]等的研究也發(fā)現(xiàn)基因型是決定小孢子培養(yǎng)能否成功的重要因素之一。本研究除001外，其余均為雜交品種，相對(duì)復(fù)雜的遺傳背景可能有利于小孢子的培養(yǎng)，這與牛應(yīng)澤等[16]研究結(jié)果一致。

活性炭在小孢子培養(yǎng)中的重要作用早已被證實(shí)[17，18]。本研究顯示，在NLN-13培養(yǎng)基中添加適宜濃度的活性炭，可明顯促進(jìn)大白菜小孢子胚的產(chǎn)生，尤其是高誘導(dǎo)率的品種，對(duì)活性炭的反應(yīng)相對(duì)靈敏，低誘導(dǎo)率品種001并未表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。有學(xué)者研究認(rèn)為，從培養(yǎng)基高溫滅菌到小孢子培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，活性炭具有吸附這些有害物質(zhì)的作用，從而促進(jìn)了小孢子胚胎發(fā)生[6，16，19]。

本研究同樣對(duì)影響子葉胚成苗的因素進(jìn)行了研究。不同基因型之間成苗率差異明顯，成苗率最高的是002，最低的是001，說(shuō)明基因型也影響成苗率的高低。因此，對(duì)001來(lái)說(shuō)，必須要大量培養(yǎng)才能達(dá)到所需的再生植株數(shù)量。

及時(shí)將子葉胚轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可有效提高成苗率。本研究顯示，子葉胚再生成苗的最適胚齡為15～25 d，超過(guò)35 d后成苗率極低，這與劉凡[20]和韓陽(yáng)[18]等研究結(jié)果相符。

本研究還顯示，培養(yǎng)基中瓊脂濃度超過(guò)1%時(shí)，可明顯提高成苗率，這與韓陽(yáng)[18]、王漢中[21]和趙冰[22]等的研究結(jié)果相符。也有學(xué)者通過(guò)在培養(yǎng)基表面夾墊濾紙、控制培養(yǎng)過(guò)程的濕度來(lái)提高成苗率[23， 24]，可見(jiàn)，培養(yǎng)基水分狀況也是影響植株再生的重要因素。

參考文獻(xiàn)：

[1]張曉東， 李利斌， 宋宜現(xiàn)， 等. 大白菜高效穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：1-7.

[2]李曉波， 楊翠翠， 邱念偉. 擬南芥和大白菜YABBY 蛋白家族的生物信息學(xué)分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（12）：1-6.

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[4]耿建峰， 原玉香， 張曉偉， 等. 利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)育成早熟大白菜新品種‘豫新5號(hào)[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2003， 30（2）： 249.

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[12]付文婷， 張魯剛， 胥宇建， 等. 大白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)及植株再生[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2010， 19（3）： 139-143.

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[16]牛應(yīng)澤， 劉玉貞， 郭世星. 提高甘藍(lán)型油菜游離小孢子產(chǎn)胚率的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2002， 15（1）： 24-27.

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[20]劉凡， 李巖， 姚磊， 等. 培養(yǎng)基水分狀況對(duì)大白菜小孢子胚成苗的影響[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 1997， 5（2）： 131- 136.

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[22]趙冰， 聞鳳英， 王玉龍， 等. 青麻葉大白菜小孢子培養(yǎng)及新品種選育[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2005， 20（2）： 26-29.

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[24]申書(shū)興， 趙前程， 劉世雄， 等. 四倍體大白菜小孢子植株的獲得與倍性鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 1999， 26（4）： 232-237.

2.1基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

由表1可以看出，供試的4個(gè)品種都獲得了胚狀體，但小孢子胚胎發(fā)生能力有一定差異。002產(chǎn)胚率最高，平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚38.25個(gè)；001最低，平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚1.28個(gè)；003與004平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚19.17和21.56個(gè)。由此可見(jiàn)，002、003和004胚胎發(fā)生較易，001胚胎發(fā)生較難。

3討論

本試驗(yàn)對(duì)基因型和培養(yǎng)基添加物質(zhì)在影響大白菜小孢子胚胎發(fā)生中的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，基因型對(duì)小孢子產(chǎn)胚率影響較大，本研究中的4個(gè)大白菜品種每花蕾產(chǎn)胚為1.28～38.25個(gè)，高產(chǎn)胚率約為低產(chǎn)胚率的30倍，曹鳴慶[14]與馬燕[15]等的研究也發(fā)現(xiàn)基因型是決定小孢子培養(yǎng)能否成功的重要因素之一。本研究除001外，其余均為雜交品種，相對(duì)復(fù)雜的遺傳背景可能有利于小孢子的培養(yǎng)，這與牛應(yīng)澤等[16]研究結(jié)果一致。

活性炭在小孢子培養(yǎng)中的重要作用早已被證實(shí)[17，18]。本研究顯示，在NLN-13培養(yǎng)基中添加適宜濃度的活性炭，可明顯促進(jìn)大白菜小孢子胚的產(chǎn)生，尤其是高誘導(dǎo)率的品種，對(duì)活性炭的反應(yīng)相對(duì)靈敏，低誘導(dǎo)率品種001并未表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。有學(xué)者研究認(rèn)為，從培養(yǎng)基高溫滅菌到小孢子培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，活性炭具有吸附這些有害物質(zhì)的作用，從而促進(jìn)了小孢子胚胎發(fā)生[6，16，19]。

本研究同樣對(duì)影響子葉胚成苗的因素進(jìn)行了研究。不同基因型之間成苗率差異明顯，成苗率最高的是002，最低的是001，說(shuō)明基因型也影響成苗率的高低。因此，對(duì)001來(lái)說(shuō)，必須要大量培養(yǎng)才能達(dá)到所需的再生植株數(shù)量。

及時(shí)將子葉胚轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可有效提高成苗率。本研究顯示，子葉胚再生成苗的最適胚齡為15～25 d，超過(guò)35 d后成苗率極低，這與劉凡[20]和韓陽(yáng)[18]等研究結(jié)果相符。

本研究還顯示，培養(yǎng)基中瓊脂濃度超過(guò)1%時(shí)，可明顯提高成苗率，這與韓陽(yáng)[18]、王漢中[21]和趙冰[22]等的研究結(jié)果相符。也有學(xué)者通過(guò)在培養(yǎng)基表面夾墊濾紙、控制培養(yǎng)過(guò)程的濕度來(lái)提高成苗率[23， 24]，可見(jiàn)，培養(yǎng)基水分狀況也是影響植株再生的重要因素。

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[5]姚秋菊， 蔣武生， 原玉香， 等. 游離小孢子培養(yǎng)育成早熟大白菜新品種‘豫新58號(hào)[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2008， 35（6）：929.

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[7]Kott L S， Polsoni L. Autotoxicity in isolated microspore culture of Brassica napus [J]. Can. J. Bot.， 1988， 66： 1665-1670.

[8]Kott L S， Beversdorf W D. Enhanced plant regeneration from microspore-derived embryos of Brassica napus by chilling，partial desiccation and age selection [J]. Plant Cell Tissue Organ Culture， 1990， 23： 187-192.

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[10]Sato T， Nishio T， Hirai M. Plant regeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage （Brassica campestris ssp. pekinensis） [J]. Plant Cell Rep.，1989，8（8）：486-488.

[11]王秀英， 巫東堂， 趙軍良， 等. 大白菜游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 蔬菜， 2012（7）：46-49.

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[24]申書(shū)興， 趙前程， 劉世雄， 等. 四倍體大白菜小孢子植株的獲得與倍性鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 1999， 26（4）： 232-237.

2.1基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響

由表1可以看出，供試的4個(gè)品種都獲得了胚狀體，但小孢子胚胎發(fā)生能力有一定差異。002產(chǎn)胚率最高，平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚38.25個(gè)；001最低，平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚1.28個(gè)；003與004平均每個(gè)花蕾產(chǎn)胚19.17和21.56個(gè)。由此可見(jiàn)，002、003和004胚胎發(fā)生較易，001胚胎發(fā)生較難。

3討論

本試驗(yàn)對(duì)基因型和培養(yǎng)基添加物質(zhì)在影響大白菜小孢子胚胎發(fā)生中的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，基因型對(duì)小孢子產(chǎn)胚率影響較大，本研究中的4個(gè)大白菜品種每花蕾產(chǎn)胚為1.28～38.25個(gè)，高產(chǎn)胚率約為低產(chǎn)胚率的30倍，曹鳴慶[14]與馬燕[15]等的研究也發(fā)現(xiàn)基因型是決定小孢子培養(yǎng)能否成功的重要因素之一。本研究除001外，其余均為雜交品種，相對(duì)復(fù)雜的遺傳背景可能有利于小孢子的培養(yǎng)，這與牛應(yīng)澤等[16]研究結(jié)果一致。

活性炭在小孢子培養(yǎng)中的重要作用早已被證實(shí)[17，18]。本研究顯示，在NLN-13培養(yǎng)基中添加適宜濃度的活性炭，可明顯促進(jìn)大白菜小孢子胚的產(chǎn)生，尤其是高誘導(dǎo)率的品種，對(duì)活性炭的反應(yīng)相對(duì)靈敏，低誘導(dǎo)率品種001并未表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。有學(xué)者研究認(rèn)為，從培養(yǎng)基高溫滅菌到小孢子培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，活性炭具有吸附這些有害物質(zhì)的作用，從而促進(jìn)了小孢子胚胎發(fā)生[6，16，19]。

本研究同樣對(duì)影響子葉胚成苗的因素進(jìn)行了研究。不同基因型之間成苗率差異明顯，成苗率最高的是002，最低的是001，說(shuō)明基因型也影響成苗率的高低。因此，對(duì)001來(lái)說(shuō)，必須要大量培養(yǎng)才能達(dá)到所需的再生植株數(shù)量。

及時(shí)將子葉胚轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可有效提高成苗率。本研究顯示，子葉胚再生成苗的最適胚齡為15～25 d，超過(guò)35 d后成苗率極低，這與劉凡[20]和韓陽(yáng)[18]等研究結(jié)果相符。

本研究還顯示，培養(yǎng)基中瓊脂濃度超過(guò)1%時(shí)，可明顯提高成苗率，這與韓陽(yáng)[18]、王漢中[21]和趙冰[22]等的研究結(jié)果相符。也有學(xué)者通過(guò)在培養(yǎng)基表面夾墊濾紙、控制培養(yǎng)過(guò)程的濕度來(lái)提高成苗率[23， 24]，可見(jiàn)，培養(yǎng)基水分狀況也是影響植株再生的重要因素。

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