，

(1.深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院 交通與環(huán)境學(xué)院，廣東 深圳 518172；2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境工程系， 廣州 510300)

1 研究背景

賈第鞭毛蟲(Giardia)是寄生于人和動物體內(nèi)的一類腸道原蟲。飲用了含有賈第鞭毛蟲的水可引起嚴(yán)重的消化道感染，甚至死亡[1]。由賈第鞭毛蟲引起的疾病稱為賈第鞭毛蟲病(Giardiasis)，常見癥狀為腹瀉、腹痛和消化不良[2]。賈第鞭毛蟲分布于世界各地，近10多年來，由于旅游事業(yè)的發(fā)展，在旅游者中發(fā)病率較高，故又稱“旅游者腹瀉”。起初，人類對賈第鞭毛蟲的認(rèn)識還不夠深入，認(rèn)為該蟲只是一種共生性的腸道原蟲。隨著世界各地賈第鞭毛蟲病的相繼暴發(fā)和流行，其危害性不斷顯現(xiàn)，人類才真正開始了對該寄生原蟲的深入研究。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，全世界人群賈第鞭毛蟲感染率為1%～30%，兒童感染率最高。因此，該寄生原蟲已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為危害人類身體健康重要寄生蟲之一[3]。

近幾年，因為病原微生物污染而造成流行病爆發(fā)事件不斷發(fā)生，如口蹄疫、SARS、甲型H1N1、禽流感等由病原體引起的流行病造成了大范圍危害和社會恐慌。水環(huán)境污染或水系傳播而引起的病原體感染仍然是當(dāng)今世界上危害范圍最廣的環(huán)境問題。水媒性病原體主要包括原生動物、細(xì)菌和病毒，其中腸道感染病原體引發(fā)的案例最多。因此，我國在2006年12月頒布的新版《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)將賈第鞭毛蟲列入需要檢驗的微生物指標(biāo)之一[4]。

目前賈第鞭毛蟲常用的滅活包括：氯氣、二氧化氯、臭氧(臭氧/過氧化氫)、紫外線(Ultraviolet，UV)和光催化劑等[5-8]。賈第鞭毛蟲外壁有一層很厚的孢囊對傳統(tǒng)的加氯消毒有很強的抵抗性[9]，而加大消毒劑量又會導(dǎo)致水中致癌副產(chǎn)物增加[10]，嚴(yán)重危害人體健康。研究顯示超聲波對水體中的原聲動物有很好的殺滅效果，而且沒有致癌副產(chǎn)物生成，超聲技術(shù)在消毒領(lǐng)域有很廣泛的應(yīng)用前景[11]。目前國內(nèi)在此領(lǐng)域研究主要針對細(xì)菌和大腸菌群等，而鮮見應(yīng)用于水中賈第鞭毛蟲滅活的報道[12-13]。

2 材料與方法

2.1 試驗裝置與試驗方法

試驗裝置如圖1所示，該裝置購于中國科學(xué)院聲學(xué)研究所東海研究站。型號為TF2460A，可選頻率20,40,60 kHz，功率(0～150)±2 W可調(diào)，容器直徑8 cm，容器高度10 cm。

圖1 超聲反應(yīng)裝置示意圖

反應(yīng)容器置于水浴槽中，控制溫度(25±1)℃，容器中加入蟲樣50 mL，其濃度為3×105個/mL，調(diào)節(jié)pH 7±0.2，超聲頻率19.8 kHz，超聲功率151 W，反應(yīng)時間10 min每隔1 min取樣1 mL進(jìn)行檢測。每組進(jìn)行3次平行試驗，試驗數(shù)據(jù)取平均值。

2.2 試驗材料

賈第鞭毛蟲(Giardia)采于患病犬，經(jīng)過篩、硫酸鋅漂浮和蔗糖梯度離心等步驟，得到濃度為5.0×106個/mL賈第鞭毛蟲樣品。以2.5%重鉻酸鉀懸浮保存于4℃冰箱。4,6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI)，普匹碘胺(PI)，Hanks平衡鹽溶液均購于Sigma (USA)。

2.3 分析方法

2.3.1 熒光染色法

采用熒光染色法[14-16]，所取樣品4℃、10 000 r/min離心5 min，用HBSS平衡溶液漂洗3次；棄上清液于160 μL，加20 μL DAPI、20 μL PI使用液，37℃避光溫浴1 h。取出樣品再用HBSS平衡溶液漂洗3次，將未染上色的DAPI與PI洗掉。處理后樣品涂片，在熒光顯微鏡下鏡檢，所用熒光顯微鏡為OLYMPUS BX-51 (Japan)。

DAPI會在450 nm紫外激發(fā)光下發(fā)出天藍(lán)色熒光，而PI會在630 nm綠色激發(fā)光下發(fā)出亮紅色熒光。DAPI能夠透過細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，而PI無法正常通過細(xì)胞膜，只有死亡的細(xì)胞才會被PI染色，因此可聯(lián)合應(yīng)用DAPI和PI判斷賈第鞭毛蟲的活性[17]。圖2為DAPI及PI熒光顯色照片。

圖2 賈第鞭毛蟲熒光染色照片

滅活率計算公式為

滅活率=PI+(DAPI+)+(PI+) ×100% 。

式中:PI+表示PI顯色;(DAPI+)表示DAPI顯色。

2.3.2 掃描電鏡

掃描電鏡(SEM)形態(tài)學(xué)研究采用HITACHI-S4700型(Japan)，樣品用1.5 mL離心管裝取，采用2.5%戊二醛固定，然后分別用50%,75%,90%,100%乙醇多次脫水，再分別用1∶1乙醇與醋酸異戊酯溶液和純醋酸異戊酯置換，置換后的樣品用針頭挑出到疊好的稱量紙中，放入干燥器中干燥12 h，最后用離子濺射鍍膜儀噴金、檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 腐殖酸對超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

腐殖酸(Humic Acid, HA)是一種水環(huán)境中常見的高分子天然有機物，其來源主要是動植物殘體經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物化學(xué)作用所形成的大分子有機物[18]。圖3為溫度(25±1)℃，超聲頻率19.8 kHz，功率151 W條件下，腐殖酸對US滅活賈第鞭毛蟲的影響。

圖3 腐殖酸對超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

從圖中可知，腐殖酸濃度與超聲滅活賈第鞭毛蟲的滅活率呈負(fù)相關(guān)。超聲作用10 min，腐殖酸濃度為0,1.0,2.0 mg/L時，滅活率分別為95.7%,93.8%和91.2%；腐殖酸濃度為20.0，50.0 mg/L時的滅活率分別為81.3%與80.6%。由上可知，隨著腐殖酸濃度增加，滅活率不斷下降，這可能是當(dāng)腐殖酸分子在氣相中或破碎的空化泡邊界時，很容易受到羥自由基的轟擊被氧化；而且，腐殖酸分子較容易進(jìn)入空化泡的氣相中，消耗了空化泡內(nèi)部的羥自由基，在與賈第鞭毛蟲的競爭中更具優(yōu)勢[19-20]，從而導(dǎo)致滅活率下降。

3.2 濁度對超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

濁度是一項重要的水質(zhì)指標(biāo)，天然水體由于含有大量的的懸浮物、膠體物質(zhì)、浮游生物以及微生物會引起濁度的變化。本試驗采用溫度(25±1)℃，超聲頻率19.8 kHz，功率151 W，濁度在0～20.0 NTU范圍內(nèi)考察濁度對超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響。

圖4 濁度對超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

從圖4中可以看出，當(dāng)濁度為0 NTU時，超聲10 min滅活率為95.7%。隨濁度的增加，滅活率升高，當(dāng)濁度為1.0 NTU時達(dá)到最佳滅活率(98.6%)。隨著濁度逐漸增加，滅活率不斷下降，濁度為2.0，5.0，10.0和20.0 NTU時，滅活率分別為95.2%，92.6%，90.8%和85.1%。究其原因，當(dāng)濁度較低時，溶液中的微量顆粒會導(dǎo)致空化氣泡發(fā)生不對稱潰陷，使原先的氣泡變?yōu)楦喔⑿〉臍馀?，增加了單位時間，單位體積內(nèi)空化泡的數(shù)量，即增加了空化作用的強度[21]。當(dāng)濁度過大時，溶液中的懸浮物質(zhì)會吸收聲波的能量，使局部聲強減弱導(dǎo)致空化作用降低[22]。

3.3 水中常見離子對超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

從圖5(a)中可以看出，當(dāng)超聲作用10 min后，未添加Ca2+時滅活率為95.7%，當(dāng)Ca2+濃度為1.0 mg/L時滅活率為96.3%，略高于未添加Ca2+的滅活率，其原因可能是少量的2價陽離子能夠吸附在細(xì)胞表面，并能夠打開某種“鹽橋”使細(xì)胞內(nèi)容物直接被攻擊[23]。但隨著Ca2+濃度逐漸增加滅活率下降，濃度為5.0，10.0，20.0 mg/L時，滅活率分別為92.8%，88.5%和86.2%，可見Ca2+在0～20.0 mg/L范圍內(nèi)對滅活的影響并不明顯。

圖5(b)為Zn2+對超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響。Zn2+濃度0～20.0 mg/L并未明顯地促進(jìn)或抑制賈第鞭毛蟲滅活率。從圖5(b)中可看出，當(dāng)超聲作用10 min后，其中Zn2+為0 mg/L，滅活率為95.7%，當(dāng)Zn2+濃度增加，分別為1.0,5.0,10.0,20.0 mg/L，滅活率為93.8%,92.5%,91.4%和90.9%。

3.4 超聲滅活賈第鞭毛蟲機制探討

圖6為超聲(151 W，19.8 kHz)作用前后賈第鞭毛蟲的掃描電鏡(SEM)照片，其中圖6(a)為超聲之前的SEM照片，圖6(b)、圖6(c)分別為超聲后的賈第鞭毛蟲SEM照片。對比3張照片可以看到，未進(jìn)行超聲作用，賈第鞭毛蟲形態(tài)較為完整，經(jīng)過10 min超聲之后照片中難以找到完整的；對比圖6中的(a)，(b)可以明顯看出，在超聲前賈第鞭毛蟲具有完整的橢圓結(jié)構(gòu)，經(jīng)過超聲后細(xì)胞扭曲、變形，形態(tài)不再完整；經(jīng)過10 min超聲作用(圖6(c))，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全破壞；也可以說明超聲滅活賈第鞭毛蟲主要是超聲破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致賈第鞭毛蟲失去活性。研究認(rèn)為，超聲的空化作用所產(chǎn)生的高速微射流的機械剪切作用是導(dǎo)致微生物失活的主要作用，超聲可以完全破壞了大腸桿菌和酵母菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)[25-26]。而本文的掃描電鏡結(jié)果說明：超聲空化所產(chǎn)生的自由基氧化作用和超聲過程中空化泡破裂所產(chǎn)生的高速微射流的機械剪切作用均是導(dǎo)致賈第鞭毛蟲死亡的主要原因。

圖6 超聲作用賈第鞭毛蟲前后掃描電鏡照片

4 結(jié) 論

(1) 腐殖酸濃度與超聲滅活賈第鞭毛蟲的滅活率呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)腐殖酸濃度達(dá)到20.0 mg/L后，腐殖酸濃度對滅活率影響不大。

(2) 濁度對超聲滅活賈第鞭毛蟲影響較為顯著，呈低濃度促進(jìn)，高濃度抑制趨勢，濁度在1.0 NTU時達(dá)到98.6%，隨著濁度增加滅活率逐漸下降，原因是濁度較低時能增加空化作用的強度，濁度較高會吸收聲波能量。

(4) 掃描電鏡(SEM)進(jìn)行的形態(tài)學(xué)觀察可見，經(jīng)過10 min的超聲之后，視野中難以找到完整的賈第鞭毛蟲細(xì)胞，表明超聲的空化作用是導(dǎo)致賈第鞭毛蟲失活的主要原因。

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