崔 靜，李 輝，田艷勛

0 引 言

喉癌在人惡性腫瘤中占比不足2%，其發(fā)病率具有較大的區(qū)域性差異，好發(fā)于60～70歲的男性，其病因尚不完全明確［1］。有研究報道，過量的吸煙、飲酒、人乳頭瘤病毒感染等均可增大患喉癌的風(fēng)險性［2］。從病理學(xué)角度看，大多數(shù)喉癌是鱗狀細(xì)胞癌。盡管近年來外科手術(shù)，放療、化療方案等均取得較大進(jìn)步，但喉鱗狀細(xì)胞癌患者的5年生存率并未明顯改善，可能與其多階段、多病灶等生物學(xué)特性有關(guān)［3］。同時，喉鱗狀細(xì)胞癌具有較大的繼發(fā)消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等惡性腫瘤的危險，積極探索其繼發(fā)其他癌變的早期生物學(xué)標(biāo)志，對惡性腫瘤的防治具有重要意義。RECK基因是一種新型抑癌基因，具有抑制腫瘤細(xì)胞再生、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用［4］。近年來，有研究表明，RECK基因表達(dá)下降與啟動子區(qū)的甲基化有關(guān)，但其在喉鱗狀細(xì)胞癌中的作用目前尚不清楚，DNA的異常甲基化是惡性腫瘤的早期事件，并可作為某些腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志［5］。本研究檢測了原發(fā)性喉鱗狀細(xì)胞癌和癌旁組織RECK基因的甲基化狀態(tài)，分析RECK基因啟動子區(qū)的甲基化是否與預(yù)后存在某種關(guān)聯(lián)，旨在為探索喉鱗狀細(xì)胞癌變的早期事件，為其預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2006年7月至2007年12月經(jīng)外科手術(shù)切除的喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本70份，標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋。所有標(biāo)本均經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷，并排除合并其他惡性腫瘤者及術(shù)前接受過化療、放療等抗腫瘤治療者。

同時收集上述患者由于治療需要而切除的癌旁組織標(biāo)本(長度＞10 mm)29例，均經(jīng)過臨床及組織病理學(xué)檢查排除惡性腫瘤。標(biāo)記好標(biāo)本號、年齡、性別等主要信息與喉臨床細(xì)胞癌標(biāo)本進(jìn)行匹配。以正常體檢的15名健康者的喉黏膜標(biāo)本為對照組。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑及儀器 蛋白酶K(北京艾比根生物技術(shù)有限公司);Tris.Base(上海拜沃生物科技有限公司);Wizard DNA Clean-Up System(Promega公司);Tap酶(Invitrogen，USA);甲基化轉(zhuǎn)移酶(M.SssI)(NEB公司，美國);引物、三氯甲烷、飽和酚、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸鈉、無水乙醇(大連寶生生物公司)。

恒溫水浴箱(SHELLAB公司，美國);高速離心機(jī)(Eppendorf公司);Gene Amp 9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI公司，美國);凝膠自動成像儀(TOCAN 320型);電泳儀(伯樂公司，美國)。

1.2.2 DNA提取 采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶K消化法進(jìn)行DNA提取，在提取之前，組織標(biāo)本經(jīng)HE染色證實腫瘤細(xì)胞的存在，并選擇惡性腫瘤細(xì)胞≥75%的區(qū)域的組織提取DNA。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾 參照《分子克隆實驗指南》進(jìn)行操作［6］:先將約 2 μg DNA 在 1.5 mL EP 管中，用雙蒸水稀釋至50 μL，加 5.5 μL 新鮮配制的3 mol NaOH后 42℃ 水浴 30 min，然后加 30 μL 10 mmol/L對苯二酚至上述水浴后的混合液中;再加入520 μL 3.6 mol亞硫酸氫鈉(配制:1.88 g 亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3 mol/L NaOH滴定溶液至PH 5.0，最終體積為5 mL)。EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液，加200 μL石蠟油，50℃避光水浴16 h。

1.2.4 修飾后的DNA純化回收 預(yù)熱樹脂10 min(37℃)，將移液器槍頭伸入石蠟油層下吸取混合液600 μL至一潔凈2 mL EP管中;然后使用 Promega wizard Clean up DNA純化回收系統(tǒng)，對修飾后的DNA進(jìn)行純化回收。

1.2.5 甲基化特異性PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系:去離子水 11.65 μL;10 × buffer 2 μL;dNTP 1.6 μL;上、下游引物各 1 μL;DNA 模板 3 μL;Tap 酶 0.15 μL;加去離子水至 20 μL。

循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min后35個循環(huán):94℃變性30 s，54℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，最后1個循環(huán)延伸5 min。

將產(chǎn)物瓊脂糖凝膠(2.5 g/L)電泳，GeneFinder染料染色。以甲基化酶處理正常人外周血細(xì)胞、去離子水分別作為甲基化陽性對照、甲基化陰性對照及空白對照。每批標(biāo)本同時擴(kuò)增甲基化和非甲基化陽性對照。

甲基化上游引物:5'-GTTAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTCGA-3'，下 游 引 物:5'-TCCAAAACCTCCCGAAAACGAAAACG-3';非甲基化上游引物:5'-GGTTAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTTGA-3'，下游引物:5'-ATTTCCAAAACCTCCCAAAAACAAAAACA-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，RECK基因啟動子區(qū)甲基化狀況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗，必要時采用Fisher確切概率法。對完成至少5年隨訪的患者行生存分析。生存曲線采用Kaplan-Meier法估計，并采用Log-rank檢驗分析不同組別的差異。危險因素與患者總體生存率的關(guān)系采用多因素COX比例風(fēng)險模型分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床及病理學(xué)特征 70例患者中，共有37例(52.86%)發(fā)生 RECK基因甲基化，經(jīng) χ2檢驗，RECK基因甲基化在不同年齡、性別，吸煙、飲酒、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，TNM分期間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);腫瘤組織中等及高分化的患者的RECK基因甲基化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于分化程度較低的患者。15名正常人喉黏膜組織均未發(fā)現(xiàn)甲基化。見表1。

2.2 喉鱗狀細(xì)胞癌及正常組織的甲基化情況 37例(52.86%)原發(fā)喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本發(fā)生甲基化，見圖1。29對喉鱗狀細(xì)胞癌-癌旁組織匹配的標(biāo)本中，喉鱗狀細(xì)胞癌組織發(fā)生RECK基因甲基化16例(55.12%)，癌旁組織發(fā)生RECK基因甲基化8例(27.59%)，經(jīng)配對四格表資料的精確概率檢驗，2組的甲基化率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029)。見表2。

2.3 RECK基因啟動子區(qū)甲基化與患者的生存預(yù)后的關(guān)系 本組70例患者中，64例完成了5年隨訪，中位無瘤生存期為41個月，中位總體生存期為52個月。本研究只針對完成5年隨訪的64例患者分析RECK基因啟動子區(qū)甲基化與生存預(yù)后的關(guān)系。經(jīng)Log-rank分析，RECK基因甲基化可明顯縮短患者的無瘤生存期和總體生存期(P=0.017，P=0.024)，見圖2。此外，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ-Ⅳ級臨床分期、腫瘤組織中等及高分化與患者較差的預(yù)后有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ-Ⅳ級臨床分期可明顯縮短患者的無瘤生存期和總體生存期。腫瘤組織中等及高分化可縮短患者的無瘤生存期。見表3。

行多因素COX回歸(ENTER)分析，無瘤生存期及總體生存期的COX回歸方程擬合效果均較好(χ2=12.374，P ＜0.001;χ2=24.123，P=0.001)，結(jié)果顯示:RECK基因甲基化是患者無瘤生存期的獨立危險因素;總體生存期的獨立危險因素為:有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、RECK基因甲基化，提示:RECK基因甲基化與喉鱗狀細(xì)胞癌患者的生存期具有重要的關(guān)系。見表3、表4。

表1 喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本不同病理參數(shù)間RECK甲基化情況比較(n=70)Table1 The status of RECK methylation in different pathological parameters(n=70)

圖1 部分組織甲基化特異性PCR電泳圖Figure1 Part of electrophoresis of methylation specific PCR

表2 29對經(jīng)匹配的喉鱗狀細(xì)胞癌及正常喉組織標(biāo)本甲基化率比較Table2 The comparison of methylation rate in 29 matched pairs of samples

圖2 64例完成5年隨訪者的無瘤及總體Kaplan-Meier生存曲線Figure2 Cancer-free and overall Kaplan-Meier survival curves of 64 patients completed the 5-year follow-up

表3 不同臨床病理參數(shù)之間的無瘤生存期及總體生存期Log-rank檢驗結(jié)果(n=64)Table3 Results of Log-rank test of cancer-free survival and overall survival between different clinicopathological parameters(n=64)

表4 多因素COX回歸分析喉癌患者預(yù)后的影響因素(n=64)Table4 The multivariate COX regression for factors influenced the prognosis of patients with laryngeal cancer(n=64)

3 討 論

RECK基因啟動子區(qū)的甲基化與許多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤有關(guān)。本研究結(jié)果顯示:RECK基因甲基化不僅在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中發(fā)生，而且在喉鱗狀細(xì)胞癌旁正常組織中也會發(fā)生，并且在15名健康者正常組織中均未見RECK基因甲基化，說明抑癌基因甲基化可作為惡性腫瘤早期發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志。本研究實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)29對喉鱗狀細(xì)胞癌組織-癌旁組織匹配的標(biāo)本中，有3例僅在癌旁組織中發(fā)生了甲基化，而相對應(yīng)的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中未發(fā)現(xiàn)RECK甲基化，提示病理學(xué)正常的組織發(fā)生RECK基因甲基化可能預(yù)示著惡性腫瘤附近的組織具有一個范圍較大的潛在的甲基化區(qū)域，在肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，因此，抑癌基因啟動子區(qū)甲基化可看做是惡性腫瘤的一類癌前病變［7］。

RECK基因一種新型抑癌基因，定位于9P13-9P12，通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopeptidase，MMP)而實現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞再生、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用［8－9］。有實驗結(jié)果表明:在惡性腫瘤組織中，MMP2、MMP9均呈高表達(dá)，特別是MMP2的陽性表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)狀態(tài)等病理特征具有重要關(guān)系［10－11］。有研究提示，RECK基因高表達(dá)的腫瘤患者的生存預(yù)后明顯優(yōu)于RECK基因低表達(dá)者［12］。這與本實驗結(jié)果綜合提示:喉鱗狀細(xì)胞癌RECK基因由于甲基化而滅活，從而使患者的生存預(yù)后更差［11，13］。因此，去甲基化可應(yīng)用于抗腫瘤的治療過程中，可為改善包括喉鱗狀細(xì)胞癌在內(nèi)的惡性腫瘤患者的治療帶來新希望［15］。

以往有研究表明:吸煙、飲酒是影響惡性腫瘤患者生存的危險因素，這一規(guī)律也得到了很多學(xué)者的認(rèn)同［16］。但本研究發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒與患者的生存率關(guān)聯(lián)不大，但這并不意味著吸煙、飲酒不是喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存率的影響因素。喉癌的早期癥狀為聲音嘶啞、有異物感、痰多、咽部不適等，這些癥狀的存在，可能會使患者減少吸煙、飲酒，從而減弱了其與喉鱗狀細(xì)胞癌的真實關(guān)聯(lián)。因此，吸煙、飲酒仍然是影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者生存的潛在危險因素，并具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本研究重點分析了RECK基因啟動子甲基化狀況與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果表明:甲基化的RECK基因檢測是預(yù)測患者較差預(yù)后的新途徑，越來越多的研究結(jié)果支持這一觀點［12－13］。

RECK基因啟動子區(qū)甲基化是人喉鱗狀細(xì)胞癌的早期事件，在癌旁正常組織中也可發(fā)生，并且與患者較差的預(yù)后有重要關(guān)聯(lián)。RECK基因啟動子區(qū)甲基化可作為一個重要的早期發(fā)現(xiàn)并預(yù)測患者預(yù)后的早期生物標(biāo)志物。

［1］Sarafoleanu D，Postelnicu V，Iosif C，et al.The role of p53，PCNA and Ki-67 as outcome predictors in the treatment of laryngeal Cancer［J］.J Med Life，2009，2(2):219-226.

［2］Francis DO，Yueh B，Weymuller EA Jr，et al.Impact of surveillance on survival after laryngeal cancer in the Medicare population［J］.Laryngoscope，2009，119(12):2337-2344.

［3］Hafidh M，Tibbo J，Trites J，et al.Radiotherapy for T1 and T2 laryngeal cancer:the dalhousie University experience［J］.J Otolaryngol Head Neck Surg，2009，38(4):434-439.

［4］Correa TC，Brohem CA，Winnischofer SM，et al.Downregulation of the RECK-tumor and metastasis suppressor gene in glioma invasiveness［J］.J Cell Biochem，2006，99(1):156-167.

［5］Murai R，Yoshida Y，Muraguchi T，et al.A novel screen using the Reck tumor suppressor gene promoter detects both conventional and metastasis-suppressing anticancer drugs［J］.Oncotarget，2010，1(4):252-264.

［6］薩姆布魯克，拉塞爾著，黃培堂譯.分子克隆實驗指南［M］.北京:科學(xué)出版社，2002:898-899.

［7］Li SL，Gao DL，Zhao ZH，et al.Correlation of matrix metalloproteinase suppressor genes RECK，VEGF，and CD105 with angiogenesis and biological behavior in esophageal squamous cell carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2007，13(45):6076-6081.

［8］Stein VM，Puff C，Genini S，et al.Variations on brain microglial gene expression of MMPs，RECK，and TIMPs in inflammatory and non-inflammatory diseases in dogs［J］.Vet Immunol Immunopathol，2011，144(1-2):17-26.

［9］王震凱，汪芳裕.DNA甲基化與腫瘤［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2011，24(6):641-645.

［10］Chung TT，Yeh CB，Li YC，et al.Effect of RECK gene polymorphisms on hepatocellular carcinoma susceptibility and clinicopathologic features［J］.PLoS One，2012，7(3):e33517.

［11］范 博，張開立，張 亮，等.DNA甲基化在腎癌診治的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2011，24(8):870-873.

［12］Zhang C，Ling Y，Zhang C，et al.The silencing of RECK gene is associated with promoter hypermethylation and poor survival in hepatocellular carcinoma［J］.Int J Biol Sci，2012，8(4):451-458.

［13］Wittschieber D，Stenzinger A，Klauschen F，et al.Decreased RECK and increased EMMPRIN expression in urothelial carcinoma of the bladder are associated with tumor aggressiveness［J］.Pathobiology，2011，78(3):123-131.

［14］王文輝，汪芳裕，沈蕓竹，等.CpG甲基轉(zhuǎn)移酶誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的實驗研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25(9):905-907.

［15］Chung TT，Pan MS，Kuo CL，et al.Impact of RECK gene polymorphisms and environmental factors on oral Cancer susceptibility and clinicopathologic characteristics in Taiwan［J］.Carcinogenesis，2011，32(7):1063-1068.

［16］Furumoto K，Arii S，Mori A，et al.RECK gene expression in hepatocellular carcinoma:correlation with invasion-related clinicopathological factors and its clinical significance.Reverse-inducing--cysteine-rich protein with Kazal motifs［J］.Hepatology，2001，33(1):189-195.