甄 鑫，顏桂軍，孫海翔，喬 迪，王 勇

0 引 言

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是最常見的育齡婦女內分泌疾病，全球范圍內的發(fā)病率在5%～10%［1］。卵巢功能障礙是PCOS患者的核心病理生理問題，可導致竇卵泡發(fā)育停滯，無法進一步轉化為成熟卵泡，而卵巢多囊樣改變、持續(xù)無排卵和高雄激素血癥是疾病的基本臨床特征［2－3］。目前研究顯示，PCOS是一種涉及多器官、多系統(tǒng)的復雜性疾病，與2型糖尿病、高血壓、高血脂以及子宮內膜癌等疾病的發(fā)生有關，對患者的健康有長期影響［2，4－5］。

越來越多的證據(jù)顯示PCOS發(fā)病具有顯著地家族聚集性。遺傳因素在PCOS發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色，而雄激素的過量產生是PCOS的核心病理生理特征之一［6］。因此，雄激素代謝路徑上的多種酶的編碼基因如 HSD17B6、CYP19、CYP17等均曾被檢驗基因多態(tài)性，并發(fā)現(xiàn)數(shù)個陽性的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點［7－8］。其中 CYP19 基因編碼產物芳香化酶在雄激素代謝中發(fā)揮重要作用，因此該基因上的SNP在高雄激素血癥的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。

本研究采用病例-對照研究的方法探索SNP對PCOS易感性的影響，并將不同基因型的血清激素水平進行比較，探索SNP與PCOS發(fā)病及性激素相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究共納入2007年1月至2012年12月就診于南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院的373名PCOS患者作為PCOS組，以同期313名正常對照者作為對照組，均為中國漢族女性。PCOS的診斷采用2003年的鹿特丹標準(The Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group，2004)［9］，當滿足以下 2 條以上時，即可診斷PCOS:①臨床或者生化檢查確診的高雄激素血癥，②月經稀少或者無月經，③超聲檢查發(fā)現(xiàn)卵巢多囊表現(xiàn);排除標準:高泌乳素血癥，庫欣綜合征等其他引起高雄激素血癥的疾病。對照組入選標準為:①月經周期正常，②基礎生殖激素水平檢測結果正常;排除標準:①肥胖、多毛、皮脂過多等高雄激素表現(xiàn);②糖尿病家族史;③胰島素抵抗。

本研究獲得南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象或親屬均簽訂了知情同意書。

1.2 數(shù)據(jù)收集 本研究收集了所有受試者的初潮年齡(age at menarche，AAM)、身高、體重等數(shù)據(jù)，計算了體重指數(shù)(body mass index，BMI)。所有受試者采血前3個月內均未接受任何激素治療，如口服避孕藥等。對于仍有月經的受試者，外周血標本在月經周期的第3～5天獲取，而對已經絕經的患者則在任意時間獲取。所有的外周血標本均在12 h禁食后的早晨8:00－9:00點抽取。血標本取得后均立即離心并將血清儲存在－80℃冰箱中，血清中各種性激素的測量采用放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)，包括黃體生成素(luteotropichormone，LH)、促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、雌激素、睪酮。雌激素/睪酮值被用來評估芳香化酶的活性。

1.3 實驗方法 所有受試者的DNA提取自外周血標本，應用 Chelex?-100(Promega，Madison，WI，USA)作為介質從白細胞中提取。采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)對CYP19基因rs2899470多態(tài)性位點進行分型。上游引物序列5'-CAGGTAGCTCTGTGGAATAGCC-3'，下游引物序列為5'-GCAGAAAATTAATGAGGACCACAG-3'。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SAS 9.1.3軟件進行統(tǒng)計學分析，率的比較用χ2檢驗和精確概率法。計量資料用均數(shù)±標準差()表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，2組均數(shù)比較用t檢驗。血清激素水平的比較采用協(xié)方差分析，以年齡和BMI為協(xié)變量，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。同時PCOS和對照組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg分布也進行了χ2檢驗，P＞0.05被認為符合Hardy-Weinberg分布。

2 結 果

對照組與PCOS組在年齡、BMI、激素水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，在AAM方面差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.01)。見表1。經檢測，rs2899470位點符合Hardy-Weinburg平衡(P=0.96)。所有686名研究對象等位基因型分布為GG 289(42.1%)、TG 337(49.1%)、TT 60(8.7%)，PCOS 組和對照組之間等位基因型和等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表2。

PCOS組雌激素/睪酮值與rs2899470基因型有關，PCOS組患者間GG、TG、TT等位基因差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。無論在 PCOS組還是對照者，除雌激素/睪酮值外的其他激素水平以及年齡、BMI等基本參數(shù)在不同等位基因型之間差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表3。

表1 PCOS組和對照組基本情況以及激素水平比較()Table 1 Demograhic characteristics and hormone levels of the PCOS patients and healthy controls()

表1 PCOS組和對照組基本情況以及激素水平比較()Table 1 Demograhic characteristics and hormone levels of the PCOS patients and healthy controls()

組別 n 年齡(歲) BMI(kg/m2) FSH(IU/L) LH(IU/L) LH/FSH 雌激素(pg/mL) 睪酮(ng/mL) AAM(歲)對照組 313 32.14 ±4.66 21.29 ±3.23 8.04 ±3.00 4.96 ±2.76 0.67 ±0.42 43.38 ±19.52 1.19 ±0.97 14.88 ±1.83 PCOS 組 373 26.86 ±5.10 22.81 ±4.07 6.53 ±4.77 13.0 ±9.68 2.23 ±1.65 50.76 ±25.80 2.72 ±2.35 14.23 ±2.06 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.001 0.0020.204

表2 PCOS組和對照組CYP19基因rs2899470多態(tài)性位點等位基因頻率及各基因型頻率分布［n(%)］Table 2 Frequency of allelic genes and distribution of genotypes of rs2899470 in the PCOS patients and healthy controls n(%)

表3 Rs2899470位點基因型與基本參數(shù)以及性激素水平相關性Table 3 Association of genotypes of rs2899470 and hormone levels in the PCOS patients and healthy controls

3 討 論

SNP是人類可遺傳變異中最常見的一種，具有數(shù)量多、分布廣、密度大、突變率低等特點，對疾病在基因中定位的研究有重要的作用，至今仍是尋找PCOS發(fā)病相關基因的主要手段。本研究結果提示，PCOS組和對照組在 CYP19基因上的 SNP位點rs2899470等位基因頻率分布上存在差異。

CYP19A1基因位于染色體15q21.2區(qū)位，包括30 kb的編碼區(qū)和93kb的調控區(qū)，其編碼產物芳香化酶在性腺內、外組織中都是雌激素合成的關鍵酶。SNP rs2899470位于該基因的10號內含子，與血清多種類固醇激素如睪酮、雌激素等的水平息息相關［10－11］。Eriksson等［12］的研究顯示，位于 CYP19A1上的 SNP rs2470152對高加索婦女血清雌酮水平具備良好的預測性，而rs2899470與血清雌激素水平的相關性則稍弱。本研究結果顯示，在 PCOS患者中，雖然rs2899470的不同基因型與雌激素水平并無顯著聯(lián)系，但GG基因型受試者的雌激素/睪酮值明顯要低于TT基因型受試者，提示芳香化酶活性的降低。這一結果與Jiang等［13］在男性骨質疏松骨折患者中的發(fā)現(xiàn)不同，該研究發(fā)現(xiàn)基因型為GG的受試者雌激素/睪酮水平要明顯高于其他基因型的受試者，可能與不同的患者群體選取有關。

雌激素/睪酮是芳香化酶活性的重要指標，因為雄激素轉變?yōu)榇萍に匦枰枷慊傅幕钚裕鳦YP19A1正是芳香化酶的編碼基因［14］。因此，rs2899470上等位基因G可能與芳香化酶活性降低有關，進而影響了雄激素向雌激素的轉化過程。芳香化酶活性的降低可直接造成卵巢性的高雄激素血癥和PCOS的發(fā)生發(fā)展。多項過去的研究顯示，芳香化酶相關基因的突變一旦影響其正常活性，PCOS的發(fā)生率會大大升高。1993年，Ito等［15］在1名18歲的女性性幼稚癥患者中發(fā)現(xiàn)了芳香化酶缺陷與CYP19基因突變之間的聯(lián)系，并在這名患者身上觀察到了多囊卵巢以及高雄激素血癥等PCOS患者的表現(xiàn)。Belgorosky等［16］發(fā)現(xiàn)，CYP19基因上的突變與芳香化酶缺陷的發(fā)生有關，在女孩中可直接影響FSH和LH的正常負反饋(正常情況下雌激素水平的下降會導致FSH和LH水平的升高)，導致血清中FSH和LH的濃度降低和卵巢囊腫的發(fā)生。Takayama等［17］的研究則發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的竇卵泡組織完全沒有芳香化酶的活性，提示PCOS發(fā)病與芳香化酶活性之間的密切關系。因此，本研究報道的rs2899470上的GG基因型可能通過降低芳香化酶活性增加了PCOS的發(fā)生風險，表現(xiàn)為雌激素/睪酮值的顯著降低。

總之，本研究SNP的等位基因G可能是PCOS發(fā)生發(fā)展的相關基因之一，其機制可能與芳香化酶活性降低有關。

［1］Singh B，Panda S，Nanda R，et al.Effect of Metformin on Hormonal and Biochemical Profile in PCOS Before and After Therapy［J］.Indian J Clin Biochem，2010，25(4):367-370.

［2］Bates GW，Jr，Propst AM.Polycystic ovarian syndrome management options［J］.Obstet Gynecol Clin North Am，2012，39(4):495-506.

［3］李 慧，馬向華，沈 捷.育齡期肥胖多囊卵巢綜合征患者特異性臨床代謝特征分析［J］.醫(yī)學研究生學報，2011，24(7):707-712.

［4］Dumesic DA，Abbott DH，Padmanabhan V.Polycystic ovary syndrome and its developmental origins［J］.Rev Endocr Metab Disord，2007，8(2):127-141.

［5］盧 姍，馬向華，沈 捷.單藥或聯(lián)合用藥對多囊卵巢綜合征促排卵效果的對照研究［J］.醫(yī)學研究生學報，2011，24(3):263-267.

［6］Diamanti-Kandarakis E，Piperi C.Genetics of polycystic ovary syndrome:searching for the way out of the labyrinth［J］.Hum Reprod Update，2005，11(6):631-643.

［7］Jones MR，Italiano L，Wilson SG，et al.Polymorphism in HSD17B6 is associated with key features of polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2006，86(5):1438-1446.

［8］Gaasenbeek M，Powell BL，Sovio U，et al.Large-scale analysis of the relationship between CYP11A promoter variation，polycystic ovarian syndrome，and serum testosterone［J］.J Clin Endo-crinol Metab，2004，89(5):2408-2413.

［9］Rotterdam EA-SPCWG.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2004，81(1):19-25.

［10］Barrett JC，F(xiàn)ry B，Maller J，et al.Haploview:analysis and visualization of LD and haplotype maps［J］.Bioinformatics，2005，21(2):263-265.

［11］Bulun SE，Sebastian S，Takayama K，et al.The human CYP19(aromatase P450)gene:update on physiologic roles and genomic organization of promoters［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2003，86(3-5):219-224.

［12］Eriksson AL，Lorentzon M，Vandenput L，et al.Genetic variations in sex steroid-related genes as predictors of serum estrogen levels in men［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94(3):1033-1041.

［13］Jiang J，Tang NL，Ohlsson C，et al.Association of genetic variations in aromatase gene with serum estrogen and estrogen/testosterone ratio in Chinese elderly men［J］.Clin Chim Acta，2010，411(1-2):53-58.

［14］Jin JL，Sun J，Ge HJ，et al.Association between CYP19 gene SNP rs2414096 polymorphism and polycystic ovary syndrome in Chinese women［J］.BMC Med Genet，2009，10:139.

［15］Ito Y，F(xiàn)isher CR，Conte FA，et al.Molecular basis of aromatase deficiency in an adult female with sexual infantilism and polycystic ovaries［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(24):11673-11677.

［16］Belgorosky A，Pepe C，Marino R，et al.Hypothalamic-pituitaryovarian axis during infancy，early and late prepuberty in an aromatase-deficient girl who is a compound heterocygote for two new point mutations of the CYP19 gene［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88(11):5127-5131.

［17］Takayama K，F(xiàn)ukaya T，Sasano H，et al.Immunohistochemical study of steroidogenesis and cell proliferation in polycystic ovarian syndrome［J］.Hum Reprod，1996，11(7):1387-1392.