賴 靜，顧 軍，許 晶，吳 波，張文文，聶偉偉，宋 偉，汪澤興，黃桂春，管曉翔

0 引 言

當(dāng)前乳腺癌已經(jīng)成為全球女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1－2］。其發(fā)病率在我國逐年上升且呈現(xiàn)年輕化趨勢，在大中城市尤為明顯。對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展研究已成為目前的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。p53基因被認(rèn)為是目前最重要的抑癌基因，具有抑制腫瘤細(xì)胞增長、阻滯細(xì)胞周期及促進(jìn)凋亡的作用［3］。然而50%以上的腫瘤中存在p53基因突變現(xiàn)象，最終導(dǎo)致腫瘤的生長［4］。大量研究表明，野生型p53及突變型p53在乳腺癌的診斷和治療中都發(fā)揮著重要作用［5－7］。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測p53在乳腺癌中的表達(dá)，研究其在乳腺癌的診斷和預(yù)后評估中的意義;并探討了5-氮雜脫氧胞苷對p53表達(dá)調(diào)控的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 組織芯片購于西安艾麗娜生物科技有限公司，包含80例乳腺癌組織、80例同一來源的癌旁正常組織。乳腺癌患者均為女性，年齡30～70歲。病理類型:浸潤性導(dǎo)管癌72例、浸潤性小葉癌2例、黏液腺癌2例、髓樣癌3例、大汗腺癌1例。人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由本實(shí)驗(yàn)室保存。MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%進(jìn)口胎牛血清，1%雙抗及0.05%胰島素的1640培養(yǎng)液中，并置于37℃，含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 免疫組織化學(xué)及結(jié)果判定 常規(guī)組織芯片脫蠟入水，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，充分水洗，置于pH 6.0的0.01 mmol/L構(gòu)椽酸鹽緩沖液中，高壓加熱修復(fù)抗原。滴加p53抗體后37℃孵育2小時;滴加二抗，室溫孵育30 min。各步驟間以PBS沖洗5 min，連續(xù)3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。設(shè)立陽性和陰性對照。所用試劑盒及單克隆抗體均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒為陽性染色，隨機(jī)選擇10個高倍視野對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評估。陽性細(xì)胞百分率＜10%為(－)，10%～25%為(+)，26%～50%為(2+)，＞50%為(3+)。

1.3 半定量RT-PCR 乳腺癌細(xì)胞MCF-7中加入不同濃度5-氮雜脫氧胞苷(Sigma，美國)孵育48 h后，加入 TRIzol(Invitrogen)裂解液提取 RNA，1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)一步擴(kuò)增，p53引物序列:上游序列為:5'-GCAATAGGTGTGCGTCAGAA-3';下游序列為:5'-ATCTCCCAAACATCCCTCAC-3'。擴(kuò)增片段長度為165 bp，反應(yīng)體系為25 μL。循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性2 min，以94℃變性30 s、56℃復(fù)性45 s、72℃延伸45s條件循環(huán)35次，72℃ 10min。取10μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中行電泳實(shí)驗(yàn)。凝膠成像儀檢測并拍照。結(jié)果采用Image J軟件對p53基因進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

1.4 Western blot 乳腺癌細(xì)胞MCF-7中加入不同濃度5-氮雜脫氧胞苷孵育48 h后加入RIPA裂解液提取總蛋白質(zhì)。BCA試劑盒(Thermo Scientific)定量。20 μg每泳道加樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。聚丙烯酞胺凝膠電泳，分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉pVDF膜2 h，再依次進(jìn)行anti-p53抗體4℃過夜孵育、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(Abcam，美國)孵育2 h后進(jìn)行曝光顯影，觀察相應(yīng)蛋白條帶表達(dá)情況。采用Image J軟件對p53蛋白進(jìn)行定量分析，計算蛋白顯色的密度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料數(shù)據(jù)以例數(shù)(百分比)形式表示。獨(dú)立組間比較用χ2檢驗(yàn)，匹配組間等級資料比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。多組計量資料組間均數(shù)比較用單因素方差分析，多個組與同一對照組間的均數(shù)比較用Dunnet檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p53蛋白在乳腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá) p53蛋白在80例乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為41.3%(33/80)，在同一來源的癌旁正常組織中其陽性表達(dá)率為22.5%(18/80)。乳腺癌組織中p53陽性表達(dá)率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。p53陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核染色，呈棕黃色，其中(+)19例(23.8%)、(2+)9 例(11.3%)、(3+)5 例(6%)，見圖1。

表1 p53蛋白在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)情況［n(%)］Table 1 The expression of p53 in breast cancer and normal and adjacent tissue n(%)

圖1 免疫組化法測定乳腺癌及癌旁正常組織中p53蛋白的定位及表達(dá)Figure 1 The localization and expression of p53 in breast cancer and normal and adjacent tissue detected by IHC

2.2 p53蛋白與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 分析p53蛋白表達(dá)與乳腺癌病理分級及患者的年齡、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，年齡越大、病理分級越高或臨床分期越晚，其p53蛋白表達(dá)越高，但其表達(dá)在乳腺癌患者的年齡、病理分級、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等之間的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 p53蛋白表達(dá)情況與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 2 The relationship between p53 expression and clinicopathological factors in breast cancer

2.3 p53在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)及5-氮雜脫氧胞苷對p53的表達(dá)調(diào)控作用 聯(lián)合半定量RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)在MCF-7中檢測發(fā)現(xiàn)p53 mRNA及蛋白均呈低表達(dá)狀態(tài)。通過MCF-7細(xì)胞與不同劑量的 5-氮雜脫氧胞苷(0、5、10、20 μmol/L)共同培養(yǎng)48 h后，用半定量RT-PCR法檢測p53的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)p53mRNA表達(dá)增加，且隨著5-氮雜脫氧胞苷濃度增加而呈劑量依賴趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。Western blot法檢測p53蛋白表達(dá)情況，同樣發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達(dá)增加且隨著藥物濃度增加而呈劑量依賴趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)(P＜0.05)，見圖3。

圖2 半定量RT-PCR檢測不同濃度5-氮雜脫氧胞苷在MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)p53 mRNA表達(dá)Figure 2 The increase expression of p53 mRNA induced by 5-aza-2'-deoxycytidine at various concentrations in MCF-7 by RT-PCR cells

圖3 Western blot檢測不同濃度的5-氮雜脫氧胞苷在MCF-7細(xì)胞中誘導(dǎo)p53蛋白表達(dá)Figure 3 The increase expression of p53 protein induced with 5-aza-2'-deoxycytidine at various concentrations in MCF-7 by Western blot

3 討 論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制尚未被闡述清楚。作為一個核序列特異性的轉(zhuǎn)錄因子，p53位于人染色體17p13.1，其編碼的p53蛋白是相對分子質(zhì)量為53000的核磷酸蛋白質(zhì)［8］，突變后可導(dǎo)致p53所編碼蛋白的功能喪失，失去誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡發(fā)生的功能［9］。以此同時，突變p53可轉(zhuǎn)錄下游靶基因，產(chǎn)生類似癌基因特性的功能，從而加速癌癥進(jìn)展、阻止癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生等［10］。針對乳腺癌的病理特征研究中發(fā)現(xiàn)，p53蛋白表達(dá)為陽性的乳腺癌具有較強(qiáng)的增殖能力，易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較差［11－13］。說明乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展及不良預(yù)后與p53經(jīng)常發(fā)生突變有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示80例乳腺癌組織中的p53蛋白陽性率明顯高于對應(yīng)的癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示p53蛋白表達(dá)可能參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。盡管p53蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但結(jié)果顯示p53蛋白表達(dá)可隨著年齡、腫瘤惡性度及臨床分期的增高相應(yīng)地增高。這也能在一定程度上提示p53蛋白表達(dá)異常可能導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失常和細(xì)胞異常增殖促進(jìn)乳腺癌的惡性演變進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)同樣檢測了乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中p53的表達(dá)情況。半定量RT-PCR提示p53mRNA在MCF-7中低表達(dá)，同時Western blot法檢測p53蛋白發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)水平亦低。這一結(jié)果與乳腺癌組織中p53蛋白表達(dá)結(jié)果不一致。既往研究表明在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中p53表達(dá)為野生型［15］，這表明在MCF-7中p53可能表達(dá)抑癌基因作用，即在MCF-7中p53發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。另有研究表明，p53基因抗腫瘤活性丟失除了與突變、缺失等有關(guān)外，還與其啟動子區(qū)CpG島高甲基化有關(guān)，這是p53抑癌基因失活的又一重要機(jī)制［16－17］。5-氮雜脫氧胞苷作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于血液疾病的治療中，其可逆轉(zhuǎn)啟動子區(qū)的甲基化使抑癌基因表達(dá)增加，最終發(fā)揮抗腫瘤作用［18］。本研究結(jié)果顯示，無論在mRNA或是在蛋白水平上，均已證實(shí)在不同濃度5-氮雜脫氧胞苷誘導(dǎo)作用下MCF-7細(xì)胞恢復(fù)p53表達(dá)且呈劑量依賴趨勢。因此，可以推測在野生型乳腺癌細(xì)胞MCF-7中p53啟動子區(qū)可能受到甲基化調(diào)節(jié)，利用5-氮雜脫氧胞苷可使其發(fā)生去甲基化，上調(diào)p53基因的表達(dá)，最終增強(qiáng)p53抑癌基因的功能。綜上所述，本研究結(jié)果表明p53可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。而針對5-氮雜脫氧胞苷的進(jìn)一步研究有望為治療p53低表達(dá)乳腺癌藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

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