鄧輝

(武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 湖北武漢 430415)

巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)是一種單細胞真核生物,其表達系統(tǒng)是近些年發(fā)展起來的一種真核表達系統(tǒng),它與釀酒酵母有著很多相同的遺傳學(xué)和生物學(xué)特性。優(yōu)點概括為三點:高穩(wěn)定、高表達、高分泌。相對其它酵母來說更加易于操作。畢赤酵母相對其它酵母更易于分泌外源蛋白,而且外源基因整合非常穩(wěn)定,發(fā)酵工藝相對成熟,宿主細胞生長迅速。畢赤酵母能夠進行高密度的發(fā)酵,有著很強的誘導(dǎo)啟動子。不僅如此,畢赤酵母重組產(chǎn)物的生物活性比較高,其表達水平是其它酵母的10～100倍。表達可以到達75%。正是由于表達水平高,所以作為外源蛋白表達系統(tǒng)的畢赤酵母才會被廣泛運用于商業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白。其中25%的影響主要分為以下七點:(1)啟動子的影響。(2)外源基因的自身影響。(3)外源基因拷貝數(shù)的影響。(4)遺傳背景的影響。(5)蛋白質(zhì)分泌的影響。(6)發(fā)酵條件的細微影響。(7)外源蛋白的加工修飾。

1 外源基因的選擇

外源基因自身的特性主要包括三個方面:(1)mRNA5’端非翻譯區(qū)(5’-2UTR)。(2)基因的A+T組成。(3)密碼子使用頻率。由于乙醇氧化酶在畢赤酵母(P.pastoris)中的表達程度極高(約占胞內(nèi)可溶性蛋白的30%)所以外源基因mRNA5’－UTR只有盡可能和AOXl mRNA5’－UTR保持一致,這樣才會有相對較高的蛋白表達率。由于終止密碼子的A+T含量豐富,所以在A+T豐富區(qū)可能會存在轉(zhuǎn)錄提前終止的密碼子,基因在巴斯德畢赤酵母中表達時偶爾會造成轉(zhuǎn)錄活動提前終止的主要原因正是因為基因中A+T含量相對較高。因此改變這一現(xiàn)象的方法就是對A+T含量豐富的基因重新進行序列設(shè)計,使其A+T含量盡可能保持在30%～55%范圍之內(nèi),盡可能避開終止密碼子。

2 表達載體的優(yōu)化

(1)強啟動子的選擇;啟動子在轉(zhuǎn)錄時為了表達調(diào)控基因,一般會選擇Aoxl啟動子。因為甲醇誘導(dǎo)性很強,外源基因可以在其中得到更高程度的表達。使用其它啟動子所到達的表達效率則大大低于Aoxl啟動子。PGAG(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是最近在(P.pastoris)畢赤酵母中復(fù)制出來的一個組成型啟動子,該組成型啟動子不需要甲醇進行誘導(dǎo),所以其發(fā)酵工藝相對更加簡單。所以在不久的將來,它是否會成為了代替PAOX1最強的啟動子,人類對此還有待研究。(2)信號肽的選擇;分泌表達不僅可以減輕宿主細胞代謝負荷,還可以減少宿主細胞內(nèi)部的蛋白酶對外源蛋白的降解.分泌表達是如今最理想的蛋白質(zhì)表達方式。迄今為止,人類的血清蛋白和牛凝血酶均是利用外源蛋白自身產(chǎn)生的信號肽與酵母信號肽表達外源蛋白的成功典例。如果外源蛋白自身產(chǎn)生的信號肽的序列表達效果不佳,可以嘗試甲醇酵母的信號肽。

3 外源基因的整合拷貝數(shù)增加

為了可以有效地獲得高產(chǎn)量,巴氏畢赤酵母載體在宿主染色體上大多數(shù)為單拷貝整合。由于PAoxl在甲醇誘導(dǎo)下整合后穩(wěn)定,所以即使單拷貝體也可以獲得高產(chǎn)量。目前有效提高外源基因整合拷貝數(shù)的方法主要有以下三種:(1)巴氏畢赤酵母的轉(zhuǎn)換方法主要是原生質(zhì)體法、電擊法、氯化鋰法等。最近在質(zhì)粒pPIC9K上發(fā)現(xiàn)帶有G418的抗性基因,這種抗性基因可以利用轉(zhuǎn)化子對G418抗性水平快速篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。(配合電擊法效果最佳)(2)在體外載體上多次插入目的基因的片段。但是這種方法拷貝整合不穩(wěn)定,而且數(shù)量有限,所以并不常用。(3)將來自宿主或其它非必需高重復(fù)的基因片段與載體中目的基因的兩端連接,通過同源重組的方式從而達到高拷貝整合的目的。

4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

4.1 影響表達最為重要的因素就是通氣量

之前大多數(shù)會采用普通搖瓶進行發(fā)酵,由于普通搖瓶發(fā)酵的通氣效果不理想,會影響到菌體的高密度生長及表達。所以現(xiàn)在一般情況下會用發(fā)酵罐進行培養(yǎng),外源蛋白在發(fā)酵罐中的表達水平會比在普通搖瓶中發(fā)酵量高出10～100倍.從前大部分報道的結(jié)果都是在搖瓶發(fā)酵條件下產(chǎn)生的。所以推測,如果采用發(fā)酵罐進行發(fā)酵,其表達水平還將會有很大的提升空間。

4.2 影響高水平表達的重要因素之二——碳源

畢赤酵母表達培養(yǎng)基常用的碳源是甘油,但有些情況會用山梨糖醇代替甘油來作為碳源。雖然使用山梨糖醇得到的生物質(zhì)量下降,但外源蛋白的表達程度卻得到了大大的提高。相對甘油對AOX啟動子具有抑制作用的影響,結(jié)果上來看,使用山梨糖醇作為碳源表達程度上相比甘油大得多。

4.3 培養(yǎng)基組成

可用于培養(yǎng)P.Pastoris的培養(yǎng)基迄今為止主要有BMGY和FBS兩種。但因為BMGY含有磷酸緩沖液還有蛋白胨和酵母提取物,這幾種物質(zhì)可以使菌株生長更好,從而大大增加了生物量,產(chǎn)量也得到了很大程度的提高。

4.4 使用甲醇進行誘導(dǎo)的時間、用量、誘導(dǎo)方式

誘導(dǎo)的方式:(1)兩步法,首先用甘油培養(yǎng)細胞使其達到一定的濃度,再加入一定量的甲醇進行誘導(dǎo)。(2)聯(lián)合生長培養(yǎng)的方法,在早期加入甲醇誘導(dǎo)來誘導(dǎo)外源蛋白的表達。如果使用兩步法來誘導(dǎo)外源蛋白的表達,為了使得畢赤酵母能夠高效表達重組蛋白,關(guān)鍵要素就是誘導(dǎo)時的起始pH值。如果改變誘導(dǎo)時的pH值,外源蛋白表達量可以提高至少50%。使用growth-associated誘導(dǎo)甲醇酵母高水平表達外源基因,會比一般方法產(chǎn)生的結(jié)果高出近10倍。

5 結(jié)語

綜上所述,盡管畢赤酵母自身還存在許多缺點和不足,如在某些情況下會出現(xiàn)表達量低和無效分泌等。但不可否認畢赤酵母表達系統(tǒng)是外源蛋白高效表達的最佳載體,正因為如此,還有很多內(nèi)容值得我們?nèi)パ芯亢吞剿?相信隨著進一步的深入研究探索,不斷地積累經(jīng)驗和改良表達系統(tǒng),會有越來越多的外源基因在畢赤酵母系統(tǒng)中成功高效表達。畢赤酵母在生物制藥領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來越重要的作用。