彭禮繁

PENG Li-fan

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院輔助生殖醫(yī)學(xué)中心，四川 成都610072)

光照有自然光照和人工光照兩種。在通常情況下，輔助生殖(in-vitro fertilization，IVF)實(shí)驗(yàn)室的光照來自于人工光照，其光源是室內(nèi)的照明燈及各式顯微鏡的光源。光照可對生物細(xì)胞造成損傷。直接的光照可通過直接的和間接的途徑損傷生物細(xì)胞的DNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，基因突變，癌變或死亡［1］。光照對人類胚胎生長發(fā)育的影響，長久以來存有不同看法。光照一直是人類胚胎體外培養(yǎng)環(huán)境中最受爭議的因素。

1 光照種類及相關(guān)影響因素

1.1 紫外線(UV) UV 極具細(xì)胞毒性，尤其是高能量的UV 照射。胚胎對UV 照射的損傷也極為敏感，UV 照射可造成胚胎發(fā)育減緩，停滯，細(xì)胞凋亡，基因突變，染色體異常，失去著床能力等多方面的有害效應(yīng)。UV 對胚胎的損傷機(jī)理與其對生物細(xì)胞的損傷機(jī)理相同，既UV 可直接損傷DNA，也可通過多種途徑誘發(fā)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成。UV 射線對DNA 的攻擊性極強(qiáng)。除了因?yàn)閁V 的波長正好在DNA 吸收峰附近外，DNA 還不具備避免UV 損傷的保護(hù)機(jī)制，因?yàn)镈NA 不具有幾乎所有的生物組織都具有的UV 射線吸收因子(UVabsorbing agents)。因此DNA 成為生物細(xì)胞中最易受到UV 攻擊的靶子［2］。UV 造成的DNA 損傷有兩個(gè)特點(diǎn):基因突變和具毒效性。前者來自于DNA 直接吸收UV 射線后產(chǎn)生的光產(chǎn)物;后者來自于UV激發(fā)的ROS 生成。

1.2 可見光 可見光能夠?qū)ε咛サ恼ＩL發(fā)育產(chǎn)生不利的負(fù)面影響，已在眾多的研究中得以證實(shí)［3～6］。具體表現(xiàn)是:暴露于可見光后，胚胎出現(xiàn)發(fā)育遲緩，甚至發(fā)育停滯，胚胎細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死。可見光負(fù)面影響的產(chǎn)生機(jī)理與可見光誘發(fā)的ROS含量升高有關(guān)，即可見光通過誘發(fā)細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸和類脂產(chǎn)生氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致ROS 生成增加。含量升高的ROS 進(jìn)而可導(dǎo)致DNA 受損，以及細(xì)胞內(nèi)其他重要結(jié)構(gòu)被破壞。

在體外培養(yǎng)過程中，胚胎暴露于可見光是胚胎細(xì)胞內(nèi)ROS 含量明顯增高的原因之一。有的作者認(rèn)為［6］，既使是短暫的暴露也足以使ROS 的累積量達(dá)到可造成傷害的病理水平。有實(shí)驗(yàn)觀察到［7］:可見光照射5 分鐘之后，胚胎細(xì)胞內(nèi)ROS 的累積量即達(dá)到造成傷害的病理水平。Ashok 等報(bào)道［7］，將胚胎暴露于光強(qiáng)度為14000 lux 的顯微鏡可見光中，H2O2的生成量隨著光照時(shí)間的延長而增加，甚至每延長0．5 分鐘都可導(dǎo)致H2O2生成量顯著上升。

胚胎對不同波長的可見光的敏感度不同。不同波長的可見光對胚胎的損傷效應(yīng)也不同。在可見光的波長范圍內(nèi)，波長為400 ～500 nm 的藍(lán)光具有相對高的光照強(qiáng)度及組織穿透性，故對哺乳動物細(xì)胞傷害性較大。藍(lán)光的有害作用主要來自于其激發(fā)胚胎細(xì)胞產(chǎn)生H2O2，以及來自于藍(lán)光被呼吸鏈中的酶吸收后破壞細(xì)胞線粒體的能量代謝［8］。波長大于700 nm 的紅外線可導(dǎo)致人類精子產(chǎn)生過量的ROS，從而導(dǎo)致精子死亡［9］。

1.3 太陽光 在各種光照中，對胚胎最具殺傷力的是太陽光的光照。將小鼠受精卵暴露于中午的陽光中僅1 ～60 秒鐘，日后形成的囊胚中凋亡現(xiàn)象便明顯增加。囊胚移植后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組活產(chǎn)率的減少超過了60%［9］。

1.4 光照損傷與光照波長、強(qiáng)度和時(shí)間 光照對哺乳動物胚胎的損傷作用并不直接與光照強(qiáng)度和光照時(shí)間相關(guān)，而是與光照波長直接相關(guān)。紫外線(200～400 nm)，尤其是高能量的紫外線輻射對哺乳動物胚胎有著極強(qiáng)的毒性作用;可見光中的藍(lán)光(400～500 nm)及接近藍(lán)光的短波長光照對胚胎也有明顯的損傷作用;而波長大于藍(lán)光的其他可見光則負(fù)面作用明顯減小［10］。在同等光照強(qiáng)度和同等光照時(shí)間情況下，冷光源照射與熱光源照射對小鼠受精卵的損傷程度不同［11］，而冷熱光源的差別僅在于冷光源中含有更多的短波長可見光(400 ～500 nm)。不同波長的光照所誘發(fā)的H2O2的產(chǎn)生量也不同，因而對胚胎發(fā)育的干擾程度也就不同［11］。僅就光照波長敏感度而言，生物細(xì)胞對于波長小于360 nm的UV 射線最為敏感，其次是藍(lán)光(450 ～490 nm)，不太敏感的是綠光(大于500 nm)。哺乳動物胚胎對光照波長的敏感度也與一般生物細(xì)胞相類似。

在特定的光照波長下，光照對哺乳動物胚胎的損傷與光照強(qiáng)度和光照時(shí)間呈正比。即增強(qiáng)光照強(qiáng)度和延長光照時(shí)間均可使光照損傷加重。如將2-細(xì)胞的倉鼠胚胎暴露于波長為390 ～750 nm 的可見光下，隨著光照強(qiáng)度增加(200、500、900 lux)，胚胎發(fā)育至桑椹胚，囊胚的比例依次減小。若將倉鼠胚胎暴露于光照強(qiáng)度為14000 lux 的顯微鏡可見光中，隨著光照時(shí)間的延長，胚胎細(xì)胞內(nèi)H2O2的生成量逐步增加，甚至每延長0．5 分鐘光照都可看到H2O2生成量明顯上升［11］。

1.5 光照損傷與胚胎培養(yǎng)環(huán)境 光照誘發(fā)胚胎細(xì)胞內(nèi)ROS 生成增加的作用，受到胚胎培養(yǎng)環(huán)境因子的影響。這些影響因子包括:培養(yǎng)環(huán)境中O2的濃度和培養(yǎng)液中與抗氧化的有關(guān)成份。在相同的光照情況下，降低培養(yǎng)環(huán)境中O2的濃度，有助于減少ROS 的產(chǎn)生量。分析O2濃度與ROS 生成量的相關(guān)性可以看到［11］，在5% O2濃度的培養(yǎng)環(huán)境中，ROS的生成量最低;其次是20% O2濃度的培養(yǎng)環(huán)境;若當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中的O2濃度達(dá)到40%時(shí)，ROS 生成量達(dá)到最大。另外，光照誘發(fā)的ROS 生成量也受到培養(yǎng)液中某些成分的影響。在培養(yǎng)液中加入L-半胱氨酸(L-Cysteine)，或?qū)⑴囵B(yǎng)液中的酚紅(Phenolred)去除均可顯著地降低ROS 的生成，削弱光照對胚胎的損傷。

2 光照對胚胎生長發(fā)育的負(fù)面影響

在自然條件下，哺乳動物的卵子和胚胎生長發(fā)育在沒有自然光照，也沒有人工光照的母體環(huán)境內(nèi)。因而哺乳動物的卵子和胚胎不具備有對抗光照的天然防御機(jī)制。然而在體外培養(yǎng)過程中，尤其是在ART 體外培養(yǎng)流程中，卵子和胚胎處于一個(gè)完全不同于其自然生長發(fā)育的環(huán)境條件內(nèi)，他們被反復(fù)地暴露于各種波長，各種強(qiáng)度的光照之下，短者數(shù)十秒，長者數(shù)分鐘。這些非生理性的光照對胚胎的體外生長發(fā)育起著極為不良的負(fù)面影響。

Girotti 等［12］關(guān)于光照能夠破壞胚胎發(fā)育潛能的研究，大概是最早的有關(guān)光照對胚胎具有不良負(fù)面影響的報(bào)道之一。他們發(fā)現(xiàn)，來自普通照明光源中的可見光對倉鼠(hamster)卵子具有很大的傷害作用，而帶有紫外射線的熒光燈比白熾光危害性更大。繼Girotti 的報(bào)道之后，光照對胚胎的毒性作用在多種動物模型中得以證實(shí)。

早期胚胎對光照傷害極為敏感，尤其是高能量的照射。在有的物種中，光照對胚胎的損傷甚至大于溫度下降所造成的胚胎損傷。Mauthe 等發(fā)現(xiàn)［13］，小鼠受精卵在受到波長為400 ～700 nm 的冷光源燈(實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一種常見的照明光源)照射15 分鐘之后，雖然可以發(fā)育至囊胚，但形成的囊胚中調(diào)亡的細(xì)胞數(shù)量明顯增加。將這些囊胚移植后，活產(chǎn)率僅為44%，與對照組的73%差別顯著。而倉鼠受精卵在受到同樣條件的光照之后，雖然97%的倉鼠受精卵仍可以完成第一次有絲分裂，但均不能繼續(xù)向前發(fā)育，更沒有囊胚形成。無論是小鼠受精卵，還是倉鼠受精卵，短暫1 ～60 秒的中午自然日光照射(光照強(qiáng)度大于20000 lux)就足以對它們造成災(zāi)難性的傷害。

雖然不同物種的胚胎對光照的敏感度不一樣，甚至同一物種的胚胎在不同的發(fā)育階段。對光照的敏感度也不完全一樣，來源于動物模型的光照對胚胎損傷的數(shù)據(jù)未必能完全代表光照與人類胚胎的關(guān)系，但是光照對生物細(xì)胞普遍具有毒性作用的結(jié)論是確定的。Noda 等［14］對IVF 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的各種光源進(jìn)行了仔細(xì)的分析。他們測量和計(jì)算了常規(guī)IVF 流程中各項(xiàng)主要操作所用的平均暴光時(shí)間和平均光照強(qiáng)度。如在進(jìn)行取卵、ICSI、移植等操作時(shí)，卵子和胚胎暴露于顯微鏡光照下的平均光照時(shí)間為多少，操作人員所用的平均光照強(qiáng)度為多少，并且使用濾光片后各項(xiàng)數(shù)值的變化為多少。根據(jù)這些測量數(shù)據(jù)和所用光源的波長，他們計(jì)算出胚胎在各種光照情況下受到的損傷程度。根據(jù)所得數(shù)據(jù)得出結(jié)論:在常規(guī)的IVF 操作過程中，若不使用濾光片，胚胎所受到的光照已足以對胚胎造成傷害。目前這種由可見光造成的胚胎損傷并沒有引起各IVF 實(shí)驗(yàn)室的普遍注意。

3 光照對胚胎造成損傷的機(jī)理

光照對細(xì)胞具有毒性作用己在多種動物胚胎以及多種細(xì)胞株中得以證實(shí)［15］，包括人體乳腺癌細(xì)胞。雖然光照毒性作用的詳細(xì)機(jī)理尚不完全清楚，但光照毒性的兩個(gè)顯著特點(diǎn)已在眾多種類的細(xì)胞中被觀察到［15］:一是光照后細(xì)胞內(nèi)的DNA 被破壞，二是光照后細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量顯著升高。因此有人推測［16］，除了因DNA 可吸收某種波長的射線而遭電磁波直接的破壞外，光照損傷機(jī)理可能與光照可通過多種途徑誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成，導(dǎo)致ROS 濃度異常升高，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)有關(guān)。ROS 是一類細(xì)胞有害物質(zhì)，其特征為具有一個(gè)或幾個(gè)不配對電子的分子、離子、原子或原子團(tuán)。ROS 包括超氧化物(O2-)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(singlet oxygen，1O2)、羥自由基(HO·)以及各種脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。因含有未配對電子，ROS 的化學(xué)性質(zhì)十分活潑。在正常生理情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生與被清除處于一種動態(tài)平衡之中，使ROS 的含量維持在一個(gè)正常的生理水平上。當(dāng)ROS 產(chǎn)生過量，不能被抗氧化系統(tǒng)及時(shí)清除時(shí)，作為非特異性細(xì)胞毒素，高濃度的ROS 可廣泛攻擊細(xì)胞的核酸，脂類及蛋白質(zhì)。致使DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物分子受損，相關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)受影響，致使基因突變，線粒體受損，ATP 耗竭，細(xì)胞分裂阻滯，碎片增加，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞退化及死亡。因此，光照對胚胎的損傷機(jī)理可能包括:①直接損傷DNA;②激發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS(特別是H2O2)產(chǎn)生;③破壞線粒體呼吸鏈中的酶;④引發(fā)細(xì)胞凋亡。

4 IVF 實(shí)驗(yàn)室光照損傷的控制

光照，尤其是可見光的光照對配子，受精卵以及早期胚胎的負(fù)面影響在IVF 臨床實(shí)踐中尚沒有引起足夠的注意［16］。許多IVF 實(shí)驗(yàn)室在實(shí)際操作中并未將避免光照，減少光照置入認(rèn)真考慮的范圍內(nèi)［17］。人們對光照損傷的防御措施通常僅停留在控制室內(nèi)照明和減少胚胎在培養(yǎng)箱外的暴露時(shí)間上。實(shí)際上這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。在制定預(yù)防光照損傷的措施時(shí)，有些基本要點(diǎn)需要加以明確。例如:紫外線是最具光照毒性的射線;可見光也不是安全的射線;在IVF 操作流程中，室內(nèi)照明并不是造成胚胎光照損傷的主要光照來源。卵子，受精卵和胚胎的95%光照傷害來自于顯微鏡光源。IVF 實(shí)驗(yàn)室控制光照損傷的具體措施應(yīng)該包括:①避免日光照射，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)以無窗為宜。②選擇正確的照明光源，避免在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用任何帶有紫外射線的光源，并控制實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各種光源的光照強(qiáng)度。③在顯微鏡上安裝濾光片，將小于500nm 波長的光線濾除。這是消除UV 和藍(lán)光的有效措施。④減少不必要的鏡下觀察及操作。⑤選用含有抗氧化因子的培養(yǎng)液。⑥采用低氧培養(yǎng)環(huán)境。由于光照可誘發(fā)基因突變，因此必需不斷地對光照可能造成的試管嬰兒近期和遠(yuǎn)期的安全性問題進(jìn)行評估。

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