李瓊 （綜述），黃起壬 （審校）

（1.南昌大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，南昌 330006；2.江西護(hù)理職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，南昌 330052）

基因免疫和治療是將外源目的基因轉(zhuǎn)移到機(jī)體內(nèi)，表達(dá)具有生物學(xué)功能的蛋白，達(dá)到免疫預(yù)防或治療的目的。病毒載體是常用的基因?qū)敕绞街?，而腺病毒載體由于轉(zhuǎn)基因效率高，不受靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞所限，容易制得高滴度病毒載體，且生物活性評(píng)價(jià)較簡(jiǎn)便，在基因治療和免疫方面有了越來(lái)越多的應(yīng)用。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPARs）超家族成員之一——PPARγ可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，在脂肪代謝中起到重要作用。本文就PPARγ、腺病毒載體的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)及重組腺病毒載體在PPARγ研究中的應(yīng)用綜述如下。

1 PPARγ的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)

PPARs是一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族。目前已發(fā)現(xiàn)由3種亞型，即α、β、γ 組成，分別含有 468，441 和 497 個(gè)氨基酸殘基［1］?？膳c9-順-視黃酸受體（retinoid X receptor，RXR）形成異二聚體，與輔阻遏蛋白結(jié)合，抑制靶基因表達(dá)。當(dāng)受到PPARγ配體和 （或）RXR配體激活后，PPAR/RXR構(gòu)象發(fā)生改變并與輔激活蛋白結(jié)合，共同結(jié)合到靶基因的PPARγ反應(yīng)元件（PPREs），從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。另外，PPARγ也能在配體依賴(lài)方式下通過(guò)抑制其他轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB及活化劑蛋白-1（AP-1）家族從而直接地抑制促炎癥基因的表達(dá)［2-3］。 人類(lèi)的 PPARγ 基因有 4 種亞型：PPARγ1，PPARγ2，PPARγ3，PPARγ4。上述 4 種亞型的基因基本相同。由于PPARγ1和PPARγ3擁有同一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，故PPARγ1和PPARγ3 mRNA產(chǎn)生相同的蛋白產(chǎn)物-PPARγ1。相反PPARγ2在外顯子A2和外顯子1有一個(gè)γ2-絕對(duì)編碼外顯子，從而使得PPARγ2蛋白比 PPARγ1和 PPARγ3多 30個(gè) N端氨基酸［4］。PPARγ4 和 PPARγ1、PPARγ3 一樣都編碼PPARγ1蛋白，對(duì)于它目前所知甚少。PPARγ1在脂肪組織、脾臟、外周血淋巴細(xì)胞、肝臟及骨骼肌中均有表達(dá)；PPARγ2在脂肪組織中高水平表達(dá)，而在骨骼肌僅有低水平表達(dá)；PPARγ3的表達(dá)僅限定在巨噬細(xì)胞和大腸。各亞型組織分布的不同，在體內(nèi)發(fā)揮的作用及影響因素不同。

PPARγ配體有內(nèi)源性和外源性配體，內(nèi)源性配體如花生四烯酸、LTB4、15d-PGJ2、前列腺素 A1、前列腺素D2等，外源性配體如TZDs、吲哚美辛、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑（sartans）和WY-14643、ETYA等。PPARγ通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，在糖脂代謝、脂肪形成以及在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并與多種疾病如糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

2 腺病毒載體的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)

腺病毒最早發(fā)現(xiàn)于1953年，由于它們傾向于感染上皮細(xì)胞而被命名為腺病毒（Adenovirus，Ady）。腺病毒是直徑為70～90 nm的無(wú)囊膜病毒，呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。腺病毒基因組為線狀雙鏈DNA，長(zhǎng)度約為36 kb，包裝于二十面體的蛋白質(zhì)外殼內(nèi)。基因組的末端具有40～200 bp的倒置重復(fù)序列（ITR），左端載有包裝信號(hào)Es，是腺病毒基因組復(fù)制和病毒包裝必不可少的順式作用元件，5’端有共價(jià)結(jié)合的末端蛋白（TP），與腺病毒的感染有關(guān)，對(duì)腺病毒DNA的復(fù)制起始起著重要的作用，含有TP的DNA其感染性可提高100倍［5］。腺病毒的基因組可分為兩個(gè)區(qū)，即編碼區(qū)和非編碼區(qū)。非編碼區(qū)含有順式作用元件。編碼區(qū)又可分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)兩種，前者有 El、E2、E3 和 E4 等 4 個(gè)區(qū)［6］，編碼病毒的功能蛋白，后者有L1、L2、L3、L4和L5等 5個(gè)區(qū)，編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)各區(qū)所編碼的蛋白均有所差異，El區(qū)是腺病毒感染后轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的第一個(gè)基因，具有轉(zhuǎn)錄激活其他病毒基因表達(dá)的作用；E2區(qū)則編碼與DNA復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)；E3區(qū)編碼與病毒逃避宿主免疫監(jiān)視機(jī)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，可減少感染細(xì)胞被機(jī)體免疫識(shí)別的概率；E4區(qū)基因產(chǎn)物與病毒DNA的復(fù)制、晚期基因表達(dá)等功能有關(guān)。在4個(gè)編碼早期蛋白的轉(zhuǎn)錄區(qū)中，El、E3和E4區(qū)可供插入外源基因。

腺病毒作為基因表達(dá)載體的研究起源于20世紀(jì)60年代初，當(dāng)時(shí)病毒學(xué)家觀察到腺病毒基因組可與猿猴病毒40（SV40）基因組雜交，實(shí)質(zhì)上是腺病毒基因組可承載異源性基因。自此，腺病毒成為病毒學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究對(duì)象，其作為基因載體，在重組疫苗和基因治療等方面開(kāi)發(fā)和應(yīng)用較早。與其他動(dòng)物病毒載體比較，腺病毒載體具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）宿主范圍廣，對(duì)人致病性低，腺病毒廣泛存在于人、哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)的呼吸道、眼、消化道內(nèi)，多數(shù)毒株為隱性感染，基本不致病或只引起輕微的癥狀［7］。2）腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能研究得比較深入，Ad2、Ad5 型的全序列已了解得很清楚［8］。并且腺病毒載體并不整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，而是以附加體形式游離在宿主細(xì)胞基因組外。3）能同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因，它是第一個(gè)可以在同一細(xì)胞株或組織中用來(lái)設(shè)計(jì)表達(dá)多個(gè)基因的表達(dá)系統(tǒng)。4）穩(wěn)定。腺病毒顆粒十分牢固，不易突變。5）可容納較大外源基因插入。6）免疫途徑簡(jiǎn)便。腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，給苗途徑簡(jiǎn)便（口服或氣霧吸入）［9-10］。正是由于具有以上眾多優(yōu)點(diǎn)，如今腺病毒作為載體的研究受到更為普遍的重視。

3 重組腺病毒載體在PPARγ研究中的應(yīng)用

PPARγ的生物學(xué)作用非常廣泛。PPARγ是PPAR家族中最具脂肪細(xì)胞專(zhuān)一性的成員，它是脂肪細(xì)胞基因表達(dá)和胰島素細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)者，參與脂肪細(xì)胞分化和糖脂代謝的調(diào)節(jié)［11］。其在脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程中不僅能促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化，而且也能促進(jìn)非脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成脂肪細(xì)胞，與肥胖的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［12］。 因此，PPAR-γ在脂質(zhì)代謝中作用機(jī)制一直是肥胖和糖尿病研究領(lǐng)域十分關(guān)注的問(wèn)題［13］。明確其靶基因譜有助于理解PPAR-γ對(duì)脂質(zhì)代謝影響的分子機(jī)理；對(duì)肥胖和糖尿病等復(fù)雜疾病的診斷、預(yù)防和治療具有積極意義。有研究［13］發(fā)現(xiàn)使用相對(duì)非特異性的配體激活PPARγ，能引起脂肪的生成；當(dāng)使用特異性的配體TZD時(shí)，能更強(qiáng)的生成脂肪。說(shuō)明PPARγ在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

此外，PPARγ在輔助激活因子及抑制因子的共同作用下參與癌細(xì)胞的分化、形成。許多腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)PPARγ表達(dá)很高，例如胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等，配體激活PPARγ后能抑制上述癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)分化，并誘導(dǎo)其凋亡和抑制癌細(xì)胞血管的生成。激活后的PPARγ可通過(guò)上調(diào)PTEN和p21基因的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期停留在G1期［14-15］。當(dāng)PPARγ表達(dá)量增加可使甲狀腺腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制，但在非腫瘤細(xì)胞中不能誘導(dǎo)PPARγ的表達(dá)［16］。PPARγ過(guò)量表達(dá)能明顯增加細(xì)胞凋亡，這些都說(shuō)明了PPARγ在癌癥的生成中起重要作用。

PPARγ還有許多重要的生物學(xué)作用，若能全面的了解PPARγ的功能，將對(duì)許多疾病的治療具有重大意義。腺病毒載體可以使哺乳動(dòng)物外源基因高水平表達(dá),雖然短暫,但也可表達(dá)出占細(xì)胞總蛋白30%的重組蛋白。表達(dá)后的蛋白質(zhì)要經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的翻譯、修飾后才能確保正確的折疊及功能。這樣,重組病毒表達(dá)的蛋白及哺乳動(dòng)物的蛋白就與天然蛋白相同,從而避免了這些蛋白在原核生物、真核生物、昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的弊端。成功構(gòu)建PPARγ的重組腺病毒載體，為進(jìn)一步研究PPARγ在胰島細(xì)胞、脂肪組織、骨骼肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能奠定良好基礎(chǔ)。

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