譚 紅，鄧婷婷，聶敏海

(瀘州醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院口腔內科，瀘州醫(yī)學院口頜面修復重建和再生實驗室，四川 瀘州 646000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤，每年有超過27萬人發(fā)病，是威脅人類健康的主要疾病之一，原位侵襲和遠處轉移是影響其預后的重要因素。阻止癌前病變突破基底膜轉化為浸潤癌，是OSCC早期防治的關鍵。近年來，有關上皮-間充質細胞轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的信息不斷涌現，認為EMT在腫瘤細胞浸潤和轉移過程中扮演了重要角色，促使研究者們研究并分析EMT在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制。本文對EMT的分子機制、與腫瘤轉移的關系及其調控OSCC侵襲轉移的研究進展作一綜述。

1 一般分子機制

1.1 EMT的概念 EMT是指具有極性的上皮細胞向具有運動能力的間充質細胞轉換并獲得遷移和侵襲能力的過程，涉及多種調控分子和復雜的信號網絡系統(tǒng)，與動物的多個生理和病理過程相關。細胞經歷EMT后發(fā)生一系列生物學改變，包括細胞極性消失、細胞間連接喪失、細胞游走或散在分布、上皮標志物缺失而間充質標志物重新表達等［1］。間充質細胞也可以逆向轉化為上皮細胞即間充質-上皮細胞轉換(mesenchymal-epithelialtransition，MET)。EMT和MET表現為動態(tài)轉化過程，胚胎發(fā)育過程中EMT產生的間充質細胞可以重新轉化為上皮細胞。研究發(fā)現腫瘤轉移過程中發(fā)生的MET可能與胚胎發(fā)育過程中的MET過程類似。

1.2 EMT的分型 依據EMT的發(fā)生背景、生物學行為和標志物不同將其分為3型。Ⅰ型:胚胎發(fā)育和組織分化過程中的EMT;Ⅱ型:傷口愈合、組織再生、器官纖維化中的EMT;Ⅲ型:腫瘤細胞轉移和侵襲過程中的EMT。對于Ⅲ型EMT，癌細胞經歷EMT后并不完全轉化成間充質細胞，而是具有部分EMT特性，包括上皮細胞標志物表達降低、間充質細胞標志物表達增高、基質金屬蛋白酶表達亢進等，細胞表現為低分化形態(tài)，具有浸潤性強、惡性程度高的生物學特性［2］。大量研究證實EMT參與癌細胞侵襲和轉移過程，癌標本中EMT的多個標志物與腫瘤轉移、復發(fā)率增高以及成活率下降相關。然而，只有腫瘤進展前沿的某些癌細胞經歷EMT，其他癌細胞仍然保留其上皮性狀。

1.3 EMT相關分子 參與EMT的分子包括區(qū)分上皮細胞與間充質細胞的特定標記物和可使細胞轉向間充質細胞或上皮細胞狀態(tài)的調控者。細胞經歷EMT通常表現出波形蛋白、N-鈣粘蛋白、纖連蛋白及整合素 αvβ6表達增加;E-鈣粘蛋白、橋粒斑蛋白、細胞角蛋白和occludin表達減少［3］。下面介紹最近研究報道的調控代表分子:E-鈣粘素、轉化生長因子-β(TGF-β)、轉錄抑制因子及 miRs。

1.3.1 E-鈣粘素 E-鈣粘素是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，表達于大多數上皮組織，構建相鄰細胞間的黏附連接，被認為是EMT的一個“主調節(jié)器”。EMT的一個特征性表現是細胞與細胞間粘附缺失并伴有E-鈣粘素表達減弱或缺失，其缺失可導致人類多種惡性腫瘤發(fā)展、轉移。EMT引發(fā)的細胞間粘附缺失和隨后的由整合素(如 β4，α5β1，αVβ6)介導的細胞-細胞外基質粘連是癌癥進展、侵襲和轉移的第一個關鍵步驟［4］。腫瘤細胞E-鈣粘素表達缺失和患者預后不良相關。在上皮性腫瘤進展過程中許多因素導致了E-鈣粘素表達/功能喪失，這些因素包括:E-鈣粘素的DNA甲基化、E-鈣粘素基因突變、染色體畸變、生長因子誘導激活轉錄抑制物抑制E-鈣粘素轉錄、E-鈣粘素被蛋白酶降解［5］。

1.3.2 TGF-β信號 多種生長因子誘導E-鈣粘素表達/功能缺失，促進腫瘤細胞遷移和侵襲，包括TGF-β、IL-6、HGF 及其受體 Met、EGF、IGF、FGF 等。研究發(fā)現TGF-β誘導EMT，使E-鈣粘素的DNA甲基化增加，阻止E-鈣粘素基因轉錄;撤消TGF-β，E-鈣粘素重新表達促進EMT過程逆轉［6］。TGF-β與EMT相關的其它信號傳導機制包括激活SMA和Smad蛋白質，促進細胞運動和TGF-β自分泌，進一步增強EMT過程，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K/Akt途徑依賴于Smad的激活。TGF-β還激活整合素、Notch和 Wnt信號通路，觸發(fā) EMT發(fā)生［7］。TGF-β受體表達不足的小鼠皮膚和結腸癌模型預后較好。

1.3.3 轉錄因子 幾個轉錄抑制因子家族調控EMT，包括鋅指蛋白Snail1和Snail2、兩手鋅指δEF1家族因子(δEF1/Zeb1和SIP1/Zeb2)以及螺旋-環(huán)-螺旋因子Twist和E12/E47［8］。信號通路如TGF-β、Wnt信號級聯(lián)和PI3K/AKT軸與這些轉錄抑制因子有關。這些抑制因子與E-鈣粘素基因啟動子結合后導致多種E-鈣粘素表達的表觀遺傳沉默。例如，Snail可通過三條途徑抑制E-鈣粘素表達:①誘導激活組蛋白脫乙?；福猿ソM蛋白的乙?；瑢е陆M蛋白和DNA高親和力結合，從而阻止E-鈣粘素基因轉錄;②組蛋白去乙酰化還可增強多梳抑制復合物2和DNA之間的結合，引起DNA甲基化，從而抑制 E-鈣粘素基因的轉錄［9］;③此外，Snail可上調ZEB1表達，進一步抑制E-鈣粘素表達。與Snail對E-鈣粘素表達的抑制作用一致，E-鈣粘素表達與Snail之間的負相關性已在OSCC患者中得到證實［10］。

1.3.4 miRNAs 最近研究發(fā)現，特殊的微型核糖核酸(miRs或 miRNAs)調控著 EMT，如 ZEB1和ZEB2通過miR-200(miRNA-200)家族的調節(jié)，miR-200缺失可導致EMT。其它調節(jié)ZEB1/2的miRNA包括 miR-205 和 miR-192/215［11］。調節(jié) Snail1 或Snail2 的 miRNA 包括 miR-1、miR-29b、miR-30c、miR-34和miR-203［12］。其它與 EMT相關參與蛋白質翻譯的基因包括:Y型盒結合蛋白1(YB-1)和異質核核糖核蛋白E1(hnRNP E1)。此外，EMT通過下調上皮剪接調控蛋白1和2(ESRP1和ESRP2)在基因轉錄的選擇性剪接中啟動廣泛變化［13］。

2 EMT 與腫瘤轉移

遠處轉移是癌癥發(fā)展的最后階段，并為癌癥相關死亡的主要原因。該過程由多個步驟組成，腫瘤細胞從原發(fā)部位逸出后侵入腫瘤基質，并通過內滲直接進入血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng);失巢凋亡的環(huán)境使大多數循環(huán)中的腫瘤細胞凋亡，如果腫瘤細胞生存，它們可以粘貼到內皮細胞并從循環(huán)外滲到周圍組織中到達更合適的位點;最后，腫瘤細胞遠處定植生長在新的環(huán)境［8］。癌細胞經歷EMT后能夠獲得侵入性并進入周圍間質，創(chuàng)造有利于腫瘤侵襲和轉移的微環(huán)境。EMT與腫瘤發(fā)展、侵襲、轉移、復發(fā)和耐藥密切相關。體外實驗、動物模型和臨床病例分析的數據均支持EMT在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用。癌癥發(fā)展和轉移中的EMT過程與在胚胎發(fā)育過程中觀察到的非常類似。在轉移性腫瘤形成的早期階段，癌細胞在轉移部位必須經過反向轉化即MET，使轉移腫瘤的主要病理特征與原發(fā)腫瘤一致。研究發(fā)現，去除EMT的誘導劑如TGF-β，建立缺氧環(huán)境在體外可觀察到MET。相似的過程也發(fā)生在轉移部位，需要癌癥細胞重新表達E-鈣粘素用于細胞黏附［14］。

2.1 EMT與腫瘤干細胞 越來越多的證據支持假說:大多數腫瘤含有細胞亞群，通常稱其為腫瘤起始細胞或“腫瘤干細胞”，它們具有自我更新和重新生成腫瘤中所有類型細胞的能力［15］。這些腫瘤干細胞也表達EMT標志物，可以通過其特定的細胞表面和其他標記物從腫瘤細胞中分離。此外，誘導永生化的人乳腺上皮細胞經歷EMT，發(fā)現細胞也獲得與干細胞相關的特征，如表達干細胞標記物，形成微球體的能力增加［16］。研究發(fā)現EMT表型的細胞是腫瘤干細胞的豐富來源，EMT和腫瘤干細胞之間存在著生物學聯(lián)系［17］。部分研究者認為癌癥EMT和腫瘤干細胞理論可能是一致的，腫瘤干細胞部分通過與EMT相關的過程獲得轉移能力。

2.2 EMT與腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境由細胞外基質(ECM)、癌相關成纖維細胞、肌成纖維細胞、免疫細胞及癌癥進展和轉移需要的可溶性因子組成。腫瘤微環(huán)境中癌細胞間的相互作用可以通過介質如生長因子、細胞因子和ECM蛋白的自動和/或旁分泌誘導EMT［18］。在乳腺癌細胞中，癌相關成纖維細胞的培養(yǎng)物可以誘導EMT。在原發(fā)性大腸癌的侵襲前沿去分化的間葉細胞樣腫瘤細胞中發(fā)現核β-連環(huán)蛋白表達。癌相關成纖維細胞可以誘導癌細胞經歷EMT。這些研究表明，腫瘤微環(huán)境可誘發(fā)或維持EMT［19］。同樣，OSCC 細胞可以通過 TGF-β 分泌直接誘導為肌成纖維細胞表型。TGF-β信號通過間質肌成纖維細胞可誘導肝細胞生長因子(HGF)分泌，促進腫瘤細胞增殖和侵襲。

3 EMT與OSCC侵襲和轉移

3.1 OSCC中的EMT OSCC因其侵襲性和高死亡率成為人類極具殺傷力的癌癥之一。細胞經歷EMT后表現出多種上皮標志物下調和間質標記物上調。最近的研究發(fā)現在OSCC細胞株中上皮細胞表型表現出E-鈣粘素和MMP-9下調，而間質細胞表型表現出波形蛋白和MMP-2上調，波形蛋白表達于OSCC侵襲前沿癌細胞的細胞質中。鈣粘蛋白轉換，即E-鈣粘素表達缺失而N-cadherin表達增加，是人類癌癥EMT的關鍵。Snail是EMT過程中調節(jié)E-鈣粘素蛋白的一個主要基因。在OSCC模型中，Snail轉染的細胞表現出完全的EMT表型，呈現成纖維細胞樣外觀，表達波形蛋白，E-鈣粘素轉換為N-鈣粘素以及半橋粒缺乏。此外，在這些細胞中ZEB-1和ZEB-2表達上調。在頭頸部鱗狀細胞癌模型中，大多數病例N-cadherin高表達，且N-cadherin表達與惡性行為顯著相關［20］。

3.2 OSCC中EMT相關的信號通路

3.2.1 PI3K/Akt信號通路 PI3K/Akt信號通路的激活常見于包括OSCC在內的人類癌癥，尤其是Akt-1和Akt-2過度表達于OSCC。PI3K/Akt信號轉導通路的激活是OSCC中EMT的一個重要特征。為探討Akt蛋白在OSCC中的生物學作用，研究者培養(yǎng)OSCC細胞株設計激活Akt。結果發(fā)現OSCC細胞發(fā)生EMT，并伴有E-鈣粘素、橋粒斑蛋白、β-連環(huán)素下調和波形蛋白上調。形態(tài)上，口腔鱗癌細胞失去上皮特性而獲得成纖維細胞樣特性。此外，在動物實驗中經歷EMT的細胞表現為細胞-細胞間附著降低，運動性和侵襲性增加。當Akt活性受到抑制，OSCC可發(fā)生MET及E-鈣粘素重新表達，從而恢復上皮特點［21］。這種現象是癌細胞在轉移部位定植及適應新的微環(huán)境的重要一步。Hong等［22］認為，對于OSCC患者，Akt抑制劑是一種控制癌細胞的侵襲和轉移很有前途的治療藥物。

3.2.2 TGFβ信號通路 在正常上皮細胞和細胞癌變的早期階段，TGF-β是一種抑癌基因，隨著癌變進展，癌細胞可利用TGFβ作為一種有效的的致癌活化劑。TGFβ在發(fā)育和包括OSCC在內的人類癌癥中誘導 EMT。Qiao等［23］發(fā)現用重組 TGFβ1刺激OSCC細胞后，Slug和MMP-9表達上調，而Snail的表達上升和下降與OSCC細胞MMP-2表達一致。認為Slug和 Snail是 TGFβ1觸發(fā) EMT的調控者。Richter等［24］研究發(fā)現在OSCC中EMT由多種生長因子介導，包括EGF和TGFβ1。用EGF或TGF-β1處理OSCC細胞可刺激誘導表型轉化，其波形蛋白上調和E-cadherin下調，OSCC細胞顯示侵襲力增強并粘附到I-IV膠原蛋白。TGF-β和EGF在EMT中扮演著重要的角色，調節(jié)ECM降解和促進OSCC發(fā)展。

3.2.3 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin 信號通路是細胞增殖、腫瘤發(fā)生和EMT中的一個主要信號通路。β-連環(huán)蛋白在細胞質的異常積累可誘導TCF/LEF-介導的轉錄激活，上調MMP-7，從而誘導OSCC細胞發(fā)生 EMT，促進侵襲和轉移［25］。Iamaroon等［26］發(fā)現在 OSCC中存在TGFβ信號通路異常，伴有Smad4蛋白表達減少或缺失。這些研究結果表明一些OSCC可能采用另一種信號途徑，如PI3K/Akt，MEK/ERK 或 Wnt 基因/β-連環(huán)蛋白途徑。

研究發(fā)現缺氧在EMT中發(fā)揮著關鍵作用。缺氧的微環(huán)境對于任何腫瘤細胞都是很常見的，并能通過調節(jié)轉錄抑制劑的表達與活性水平觸發(fā)EMT。在舌鱗癌組織中，缺氧誘導因子(HIF)-1α，HIF-2α，Twist-2過度表達，且這些分子(HIF-2α的除外)的過量表達與更短的生存期相關［27］。HIF-1α、HIF-2α、Twist-2中的兩個以上的標記物聯(lián)合表達對于舌鱗癌患者具有重要的預后預測作用。

4 展望

OSCC是一種破壞性疾病，目前仍是全球公共健康的一個主要威脅。研究EMT在腫瘤和OSCC中的作用及其機制，對闡明OSCC的生物學行為、尋找有效的治療方法和判定預后具有重要意義。

［1］ Voulgari A，Pintzas A.Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis:mechanisms，markers and strategies to overcome drug resistance in the clinic［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1796:75-90.

［2］ Kalluri R，Weinberg RA.The basics of epithelialmesenchymal transition［J］.Journal of Clinical Investigation，2009，119(6):1420-1428.

［3］ Creighton CJ，Gibbons DL，Kurie JM.The role of epithelial-mesenchymal transition programming in invasion and metastasis:a clinical perspective［J］.Cancer Management and Research，2013，5:187-195.

［4］ Suttichai K，Anak I.Epithelial-mesenchymal transition in Oral Squamous Cell Carcinoma［J］.ISRN Oncology，2012，5402(10):1-9.

［5］ Futreal PA，Coin L，Marshall M，et al.A census of human cancer genes［J］.Nature Reviews Cancer，2004，4(3):177-183.

［6］ Yang X，Pursell B，Lu S，et al.Regulation of β4-integrin expression by epigenetic modifications in the mammary gland and during the epithelial-tomesenchymal transition［J］.Journal of Cell Science，2009，122(14):2473-2480.

［7］ Bhowmick NA，Ghiassi M，Bakin A，et al.Transforming growth factorβ1 mediates epithelial to mesenchymal transdifferentiation through a RhoA-dependent mechanism［J］.Molecular Biology of the Cell，2001，12(1):27-36.

［8］ Weber CE，Li NY，Wai PY，et al.Epithelial-mesenchymal transition，TGF-β，and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury［J］.J Burn Care Res，2012，33(3):311-318.

［9］ Herranz N，Pasini DDiaz VM，Franci C，et al.Polycomb complex 2 is required for E-cadherin repression by the snail1 transcription factor［J］.Molecular and Cellular Biology，2008，28(15):4772-4781.

［10］ Yokoyama K，Kamata N，Hayashi E，et al.Reverse correlation of E-cadherin and snail expression in oral squamous cell carcinoma cells in vitro［J］.Oral Oncology，2001，37(1):65-71.

［11］ Wang B，Herman-Edelstein M，Koh P，et al.E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-beta［J］.Diabetes，2010，59(7):1794-1802.

［12］ Lamouille S，Subramanyam D，Blelloch R，et al.Regulation of epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transitions by microRNAs［J］.Curr Opin Cell Biol，2013，25(2):200-207.

［13］ Warzecha CC，Jiang P，Amirikian K，et al.An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition［J］.EMBO J，2010，29(19):3286-3300.

［14］ Rees JR，Onwuegbusi BA，Save VE，et al.In vivo and in vitro evidence for transforming growth factor-beta1-mediated epithelial to mesenchymal transition in esophageal adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2006，66:9583-9590.

［15］ Schepers AG，Snippert HJ，Stange DE，et al.Lineage tracing reveals Lgr5+stem cell activity in mouse intestinal adenomas［J］.Science，2012，337(6095):730-735.

［16］ Mani SA，Guo W，Liao MJ，et al.The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells［J］.Cell，2008，133(4):704-715.

［17］ Geng S，Guo Y，Wang Q，et al.Cancer stem-like cells enriched with CD29 and CD44 markers exhibit molecular characteristics with epithelial-mesenchymal transition in squamous cell carcinoma［J］.Arch Dermatol Res，2013，305(1):35-47.

［18］ Moustakas A，Heldin CH.Signaling networks guiding epithelial-mesenchymal transitions during embryogenesis and cancer progression［J］.Cancer Sci，2007，98:1512-1520.

［19］ Masaaki I，Koshi M，Takehiko Y，et al.Epithelial-mesenchymal transition in cancer development and its clinical significance［J］.Cancer Sci，2010，101(2):293-299.

［20］ Nguyen PT，Kudo Y，Yoshida M，et al.N-cadherin expression is invlvedo in malignant behavior of head and neck cancer in relation to epithelialmesenchymal transition［J］.Histology and Histopathology，2011，26(2):147-156.

［21］ Grille SJ，Bellacosa A，Upson J，et al.The protein kinase Akt induces epithelial mesenchymal transition and promotes enhanced motility and invasiveness of squamous cell carcinoma lines［J］.Cancer Research，2003，63(9):2172-2178.

［22］ Hong KO，Kim JH，Hong JS，et al.Inhibition of Akt activity induces the mesenchymal-to-epithelial reverting transition with restoring E-cadherin expression in KB and KOSCC-25B oral squamous cell carcinoma cells［J］.Journal of Experimental and Clinical Cancer Research，2009，28(3):28-38.

［23］ Qiao B，Johnson NW，Gao J.Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factorβ1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and-9 expressions［J］.International Journal of Oncology，2010，37(3):663-668.

［24］ Richter P，Umbreit C，Franz M，et al.EGF/TGFβ1 costimulation of oral squamous cell carcinoma cells causes an epithelial-mesenchymal transition cell phenotype expressing laminin 332［J］.Journal of Oral Pathology and Medicine，2011，40(1):46-54.

［25］ Iwai S，Yonekawa A，Harada C，et al.Involvement of the Wnt-β-catenin pathway in invasion and migration of oral squamous carcinoma cells［J］.International Journal of Oncology，2010，37(5):1095-1103.

［26］ Iamaroon A，Pattamapun K，Piboonniyom SO.Aberrant expression of Smad4，a TGF-beta signaling molecule，in oral squamous cell carcinoma［J］.Journal of oral science，2006，48(3):105-109.

［27］ Liang X，Zheng M，Jiang J，et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha，in association with TWIST2 and SNIP1，is a critical prognostic factor in patients with tongue squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncology，2011，47(2):92-97.