朱桂玉

(泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院，山東泰安 271021)

鈣蛋白酶(calpain)是一個依賴于Ca2+的半胱氨酸蛋白酶(通過半胱氨酸位點水解蛋白)，它水解的蛋白能在一系列生理、生化反應(yīng)中發(fā)揮作用，包括細胞骨架的形成、細胞增殖、信號傳導(dǎo)、細胞調(diào)亡與壞死、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、蛋白的合成和降解等.鈣蛋白酶與多種疾病有關(guān)，包括糖尿病、白內(nèi)障、細胞硬化癥、癌癥、杜氏肌營養(yǎng)不良、老年癡呆等.

1 鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白

在人類中，鈣蛋白酶家族一共有14個成員，在其眾多成員中，鈣蛋白酶1(calpain－1/μ－calpain)和鈣蛋白酶2(calpain－2/m－calpain)研究的最為深入.體外研究表明，各calpain成員對Ca2+的敏感度不同，5－50μM的Ca2+濃度能刺激calpain－1達到最大活性，而當Ca2+濃度為0.2－1μM能使calpain－2 活性達到最大.［1］

Calpain的眾多成員按其表達規(guī)律可以大致分為兩類，第一類是在各種細胞中組成性表達的，包括calpain －1，2，5，7，10，13 和15;其余的只在某一種或幾種細胞中表達，包括 calpain －3，6，8，9，11 和 12.比如calpain－11只在睪丸中表達，calpain－6只在胎盤中表達，calpain－3在骨骼肌，心肌和肝中特異表達［2］.

Calpain的激活原理以及其作用于靶蛋白的具體機制非常復(fù)雜，calpain的活性可以被一種特異的鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)所調(diào)控，而迄今所確定的calpastatin的唯一作用就是抑制calpain的活性.Calpastatin由唯一一個基因編碼，但是它卻能運用不同位置的啟動子以及選擇性剪切產(chǎn)生十幾種異構(gòu)體，最后翻譯成分子量為17－100多kDa不等的各種蛋白.雖然產(chǎn)生大量異構(gòu)體的具體作用還有待于進一步研究，但它們都能結(jié)合到calpain上的三個位點，其中兩個位點的結(jié)合必須有Ca2+的參與［1］.

由于calpain－calpastatin系統(tǒng)在一系列生理過程中發(fā)生重要作用，因此機體需要對其進行精細而有效的調(diào)節(jié)，近年來，隨著對calpain和calpastatin系統(tǒng)在生殖發(fā)育中的研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)calpain－calpastatin系統(tǒng)對精子和卵母細胞的發(fā)育、頂體反應(yīng)、受精以及一些常見生殖疾病，如睪丸扭轉(zhuǎn)、妊娠高血壓綜合癥等有重要作用，本文將對calpain－calpastatin系統(tǒng)在雄性生殖發(fā)育過程中的調(diào)控機制進行下總結(jié).

2 雄性生殖系統(tǒng)中鈣蛋白酶—鈣蛋白酶抑制蛋白的調(diào)控

最早關(guān)于calpain－calpastatin系統(tǒng)在雄性生殖發(fā)育中的研究始于1986年，Schollmeyer用免疫熒光技術(shù)將calpain－2定位于豬精子的頂體部位和中心粒附近，考慮到頂體反應(yīng)和Ca2+濃度密切相關(guān)，因此Schollmeyer預(yù)測calpain－2可能參與了頂體反應(yīng)［3］.Rojas等第一次在人的精子細胞內(nèi)對calpain－calpastatin系統(tǒng)進行了較全面的定位研究，發(fā)現(xiàn)calpain－1和calpain－2在精子細胞中都有分布，同時，他用免疫印記的方法獲得了一條68 kDa大小的calpastatin蛋白條帶［4］，也有研究人員在人精子細胞中得到了除68kDa以外的另一條為110kDa左右的calpastatin蛋白［5］.

Calpain家族眾多成員中已經(jīng)確定calpain－1，calpian－2和calpain－11在睪丸中存在，通過western雜交證明精子中的calpain－1和calpain－2蛋白與其他組織中的并無差異［4，6］，而calpain－11則是在睪丸中生精細胞特異表達，其蛋白序列和結(jié)構(gòu)與較保守的calpain－1和calpain－2有一定的區(qū)別，但其主要功能域都是保守的［7］.人的睪丸特異calpastatin蛋白大小大約為68kDa，由一個40個氨基酸組成的N端結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域II，III和IV組成，其中N端結(jié)構(gòu)域為睪丸特異的，其余結(jié)構(gòu)域部分和其他體細胞calpastatin蛋白完全一樣［5］.通過綠色熒光蛋白示蹤技術(shù)對其N端結(jié)構(gòu)域進行研究，發(fā)現(xiàn)其能引導(dǎo)calpastatin蛋白定位于膜上.而在小鼠中睪丸特異calpastatin蛋白中也觀察到了類似的N端結(jié)構(gòu)域，并發(fā)現(xiàn)這個結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個十四烷基化位點對其膜定位有關(guān)鍵作用，對這個位點進行定點突變后calpastatin均勻分布于精子內(nèi)［5］.

2.1 鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白在精子發(fā)育過程中的表達

Sultana研究了calpain在精子發(fā)育過程中的表達變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)calpain1在大鼠生長到20－25天左右時，即精母細胞(spermatocytes)發(fā)生減數(shù)分裂的旺盛時期，睪丸中的calpain－1基因表達量有顯著的升高，他預(yù)測calpain－1在精子細胞發(fā)生過程中有重要作用，而calpain－2保持相對穩(wěn)定［8］.在小鼠中，在精子發(fā)育的各個階段都能檢測到calpain－1和calpain－2的mRNA以及蛋白的表達，而calpain－1在晚期的次級精母細胞(second spermatocytes)和早期的精細胞(spermatids)中表達量顯著升高［9］，這一現(xiàn)象與大鼠中的相同.Calpain－2在小鼠精子發(fā)育中的表達也相對穩(wěn)定，與calpain－1不同的是，calpain－2在輸精管的周圍細胞中也有少量表達［9］.Calpain－11是睪丸特異表達的蛋白，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)calpain－11的mRNA和蛋白在處于粗線期的精母細胞(pachytene spermatocytes)中才開始表達，同樣在成熟精子的頂體部位也能檢測到其蛋白存在［7］.

Wei等利用熒光原位雜交技術(shù)對calpastatin在人睪丸中進行了定位和表達分析，發(fā)現(xiàn)calpastatin的mRNA在精細胞中大量分布，由于精細胞是由次級精母細胞經(jīng)過第二次減數(shù)分裂后產(chǎn)生的，說明calpastatin在減數(shù)分裂后的精子發(fā)育中有重要作用［10］.同樣，在小鼠中，calpastatin基因只在單倍體的生殖細胞中表達，如精細胞，而在雙倍體的生殖細胞中沒有表達，如精母細胞［5］.

總結(jié)各研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，calpain－1和calpain－2在各種生精細胞中都有表達，而calpastatin在還未發(fā)生減數(shù)分裂的精母細胞中沒有表達，只在進入減數(shù)分裂后的精母細胞中表達，由于發(fā)生減數(shù)分裂的精母細胞是發(fā)生調(diào)亡程度較高的細胞，因此calpastatin的這種時期特異表達可能與精母細胞的調(diào)亡有一定聯(lián)系.精母細胞自身發(fā)生調(diào)亡，將活力低和有突變的細胞淘汰掉對提高精子質(zhì)量有重要作用.Somwaru等成功的用轉(zhuǎn)基因小鼠的方法將calpastatin基因在精母細胞中進行異位表達，接著利用熱刺激誘導(dǎo)睪丸內(nèi)的細胞發(fā)生調(diào)亡，結(jié)果顯示粗線期的精母細胞是發(fā)生調(diào)亡程度最高的細胞，而轉(zhuǎn)基因小鼠中調(diào)亡細胞的數(shù)量比正常小鼠顯著減少，說明calpastatin有抑制精母細胞調(diào)亡的作用［11］.Coureuil等利用一個不育轉(zhuǎn)基因小鼠品系(MTp53)，該小鼠能在次級精母細胞和精細胞中異位過表達P53，使這些細胞發(fā)生調(diào)亡而產(chǎn)生不育.經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)calpain－1在這兩類細胞中表達升高，而當加入calpain的抑制劑后，細胞的調(diào)亡現(xiàn)象在一定程度上被抑制，說明calpain在這兩類細胞的調(diào)亡過程中起到了關(guān)鍵作用［12］.以上結(jié)果分別從正反兩方面證明了calpain－calpastatin系統(tǒng)在生精細胞的末端分化和調(diào)亡過程中發(fā)揮了重要作用.

2.2 鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白在精子中的分布與頂體反應(yīng)

研究人員對calpain－calpastatin蛋白在精子中的空間分布規(guī)律進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)calpain主要分布在精子頭部的頂體部位［5，6，9］以及頸部［13］，進一步的研究發(fā)現(xiàn)在短尾獼猴的精子的頂體外膜和細胞漿膜之間，分布于大量的calpain－1和calpain－2蛋白［14］.Calpastatin蛋白也主要分布在精子頭部相同的區(qū)域［14］.Ozaki等發(fā)現(xiàn)在體外的精子中加入少量孕酮后，精子內(nèi)的鈣離子濃度顯著升高，同時還使calpain－1蛋白，由頭頸部轉(zhuǎn)移到頸部和尾部，但是具體機制不明確［13］.

獲能的精子滲入卵母細胞前要發(fā)生頂體反應(yīng)(acrosome reaction)，而Ca2+是頂體反應(yīng)中所必須的，calpain－calpastatin蛋白在頂體附近的分布以及其與Ca2+濃度的密切關(guān)系說明該系統(tǒng)可能在頂體反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用.Rojas和Moretti－Rojas最早對calpain－calpastatin系統(tǒng)在頂體反應(yīng)中的作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)在精子中加入calpain的抑制因子(calpain inhibitor－I)后，精子的滲入率顯著降低，但是該抑制因子對精子活力以及卵母細胞沒有明顯作用，此外，加入calpain－1和calpain－2的抗體同樣對頂體反應(yīng)有抑制作用［15］.隨后，大量研究表明calpain的各種抑制劑能不同程度的降低精子活力以及抑制頂體反應(yīng)的發(fā)生［6，13，9，16］.Ashizawa等首次對禽類的精子中的 calpain 蛋白進行了研究，由于禽類動物的體溫為40℃，其頂體反應(yīng)和受精機理與哺乳動物有一定的區(qū)別.Ashizawa等發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度在雞的精子活力和頂體反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，體外實驗表明，Ca2+濃度升高可以提高雞精子的活力和促進頂體反應(yīng)，而用PD 150606(特異的calpain抑制劑)對精子進行處理后，對頂體反應(yīng)沒有影響，但對精子的活力有抑制作用，進一步的實驗發(fā)現(xiàn)PD 150606對去膜后的精子的活力沒有影響，說明發(fā)揮功能的calpain蛋白主要分布在雞精子的膜部位［16］.

3 鈣蛋白酶－鈣蛋白酶抑制蛋白與某些雄性生殖疾病的關(guān)系

雄性哺乳動物的睪丸扭轉(zhuǎn)(Testicular torsion)會導(dǎo)致睪丸內(nèi)細胞的缺血并發(fā)生壞死或者調(diào)亡，細胞會產(chǎn)生大量的一氧化氮，同時calpain蛋白的活性也顯著升高，在此過程中如加入calpain的抑制劑，抑制calpain的蛋白水解活性，可以抑制精原細胞的調(diào)亡和壞死，從而說明抑制calpain可以對睪丸扭轉(zhuǎn)損傷的恢復(fù)有一定作用，calpain蛋白可以作為治療睪丸扭轉(zhuǎn)一個藥物靶點［17－18］.Umemoto等進一步研究了發(fā)生睪丸扭轉(zhuǎn)過程中未發(fā)生損傷的細胞中的calpain蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)當大鼠一側(cè)的睪丸發(fā)生睪丸扭轉(zhuǎn)損傷后，在另一側(cè)的睪丸的精母細胞核中發(fā)現(xiàn)了大量的calpain－1，而calpain－2沒有觀察明顯的變化，在未發(fā)生損傷的外周細胞中同樣發(fā)現(xiàn)了調(diào)亡的現(xiàn)象，而calpain抑制劑也可以抑制這些細胞的調(diào)亡［19］.

4 展望

總之，目前的研究表明calpain－calpastatin在雄性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用.隨著對calpaincalpastatin在生殖系統(tǒng)中的研究的逐漸深入，有望對這一系統(tǒng)在生殖調(diào)控方面的功能和發(fā)揮作用的具體機制有更準確的了解，在臨床上可以利用它們作為藥物的靶位點，為治療相關(guān)疾病提供新途徑，還可以運用到動物生產(chǎn)領(lǐng)域，提供動物的繁殖力，更好的為人類服務(wù).

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