關(guān)桂英 王風(fēng)朝

山東莘縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，山東莘縣 252400

食物中毒有很大一部分是因?yàn)槭秤眉?xì)菌性食物，而在食物中毒時(shí)，如何快速準(zhǔn)確的檢測出病癥根源依舊是檢測機(jī)關(guān)開展工作的難點(diǎn)。傳統(tǒng)的診斷辦法是對(duì)吸入食物的殘留樣品進(jìn)行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)觀察，最終得出結(jié)論，但是這種方式耗時(shí)長、資源消耗大，并且容易造成污染，另外檢測受到培養(yǎng)技術(shù)的過多局限，容易造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確等問題，常規(guī)PCR檢測只能針對(duì)性地檢測出單個(gè)細(xì)菌體，所以在涉及較多細(xì)菌時(shí)，其檢測的工作量較大，與傳統(tǒng)的檢測方式一樣存在缺陷，另外多重PCR檢測技術(shù)也由于其特異性和敏感性不高，同樣在食品檢測中存在不足，因此將以上兩種檢測方式結(jié)合，優(yōu)化PCR檢測流程和方式，使其能夠同時(shí)檢測致病的六種病菌，提高檢測效率的同時(shí)也保證了檢測的準(zhǔn)確性。本文正是基于此，對(duì)多重PCR檢測體系進(jìn)行深入研究，具體研究成果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試劑資料 實(shí)驗(yàn)主要試劑為Taq酶、PCR緩沖液以及細(xì)胞裂解緩沖液，均購買于Promega公司。試劑盒為瓊脂糖DNA純化試劑盒，由青島生物科技公司制作，6對(duì)主要對(duì)引物均來自上海生物科技公司。

1.1.2 檢測儀器 包括Centri-fuge FRESCO 17低溫告訴離心機(jī)、DYY-6C電泳儀器、HDLⅡ生物安全柜、SPX-250B-Z培養(yǎng)箱、超純水以及凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.3 菌種類型 包括蠟樣芽孢桿菌、腸炎沙門菌、大腸埃希菌、腸毒性大腸埃細(xì)菌、血性弧菌、葡萄糖細(xì)菌、副溶血性弧菌、福氏志賀菌，均由本市疾控中心提供。

1.2 一般方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將沙門菌融于氯化鎂孔雀綠肉湯中，保持37°C的溫度持續(xù)培養(yǎng)1d；志賀菌接種于GN增菌液，保持37°C培養(yǎng)1 d；腸毒性大腸埃希菌與營養(yǎng)肉湯相接種，同樣維持37°C的溫度培養(yǎng)1d，副融血性弧菌與堿性蛋白胨水相接種，保持37°C培養(yǎng)18h，葡萄球菌與胰蛋白胨大豆肉湯，保持37°C培養(yǎng)1 d，蠟樣芽孢桿菌與胰酪胨大豆多黏菌素肉湯，保持37°C培養(yǎng)約20 h。

1.2.2 PCR引物設(shè)定 首先根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫明確6種微生物的DNA序列，利用DNA序列數(shù)據(jù)庫的眾多資源研究特異屬性，后開展靶序列選取，找到這6中致病細(xì)菌的對(duì)應(yīng)PCR引物，當(dāng)引物設(shè)計(jì)完成后利用Blast能夠計(jì)算兩個(gè)序列中具有相似性序列的功能，挑選出與DNA序列數(shù)據(jù)庫的同源性低于40%的PCR引物，并且保證兩者的特異性。

1.2.3 樣品采集 主要采集100例食物中毒患者的嘔吐、腹瀉物共計(jì)146份，還包括攜帶病菌的食物或飲品。

1.2.4 常規(guī)PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù) 首先保持溫度在95°C，持續(xù)3min，單個(gè)循環(huán)過程溫度保持94°C，時(shí)長30 s，一共反映35個(gè)循環(huán)，待58°C時(shí)停火1 min，而72°C時(shí)延伸1min，等循環(huán)完成后，延伸10min，使溫度下降至16°C，4°C時(shí)存儲(chǔ)產(chǎn)物，以便于下次使用。利用凝膠成像系統(tǒng)和3%瓊脂糖凝膠電泳檢查5 μL PCR產(chǎn)物，剩下的均4°C進(jìn)行保存。

1.2.5 常規(guī)PCR退火溫度控制 基于6種主要致病細(xì)菌的退火溫度設(shè)定PCR反應(yīng)的退火溫度范圍在50～62°C，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，后通過電泳圖條帶的亮度反映來控制退火溫度。

1.2.6 多重PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù) 保持95°C下預(yù)變性3 min，持續(xù)40個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)維持 94°C 變性 30s，62°C ?；?1 min，同樣于72°C時(shí)延伸1 min，40個(gè)循環(huán)均完成后延伸10 min，待其冷卻到16°C，4°C時(shí)存儲(chǔ)產(chǎn)物，同樣利用凝膠成像系統(tǒng)和3%瓊脂糖凝膠電泳檢查5 μL PCR產(chǎn)物，剩下的均4°C進(jìn)行保存。

1.2.7 多重PCR退火溫度控制 以腸毒性大腸埃細(xì)菌、蠟樣芽孢桿菌以及副溶血性弧菌為例，基于多重PCR反應(yīng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)以上三種病菌類型的退火溫度為48～72°C，同樣使用瓊脂糖凝膠電泳檢測方式，根據(jù)電泳圖條帶呈現(xiàn)的亮度情況選擇適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟取?/p>

1.2.8 常規(guī)以及多重PCR檢測敏感度對(duì)比 測定選取的葡萄球菌、腸炎沙門菌和蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA濃度，并且使其變?yōu)?0ng/μL，并且進(jìn)行十倍稀釋，保證敏感度測驗(yàn)的DNA濃度在 2×10-2～2×10-10ng/μL， 后在每個(gè)濃度中各選擇 2μl進(jìn)行常規(guī)以及多重PCR檢測對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)PCR檢測與多重PCR檢測靈敏度對(duì)比結(jié)果

通過常規(guī)PCR檢測和多重PCR檢測的敏感度比較，經(jīng)過10倍稀釋后的葡萄糖菌、蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA、腸炎沙門菌得知，常規(guī)PCR在DNA含量較低的情況下仍舊可以反映出清晰特異性的目的條帶，而多重PCR只能擴(kuò)增出葡萄球菌以及蠟樣芽孢桿菌，當(dāng) DNA 濃度低于 2×10-2～2×10-1ng/μL 時(shí)，無法檢測出蠟樣芽孢桿菌，而低于 2×10-2～2×10-3ng/μL 時(shí)，只等對(duì)葡萄球菌進(jìn)行擴(kuò)增，DNA 濃度不高于 2×10-2～2×10-7ng/μL 時(shí)候無法擴(kuò)增。由此得知常規(guī) PCR 檢測敏感度為 2×10-2～2×10-7ng/μL，多重PCR的檢測敏感度是 2×10-2～2×10-6ng/μL。

對(duì)100例患者146份食品中毒樣本進(jìn)行以上兩種檢測，發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌均可檢測出來，但是兩種PCR檢測對(duì)比分析后，常規(guī)PCR能從較多的樣品中檢測出這一細(xì)菌，而多重PCR檢測相比而言從樣品中檢測出副溶血性孤菌的概率較低。

2.2 常規(guī)PCR、多重PCR退火溫度優(yōu)化

常規(guī)PCR反應(yīng)在退火溫度不高的的情況下，例如50°C的退火溫度，6種主要致病菌都能反映出特異性擴(kuò)增條帶，但條帶亮度呈現(xiàn)效果不明顯，而當(dāng)溫度較高，處在58°時(shí)反應(yīng)出的電泳條帶更為清晰，因此可以說溫度較高的情況下達(dá)到的PCR檢測結(jié)果也更為滿意。但是溫度過高，即到達(dá)62°C時(shí)，葡萄球菌產(chǎn)物反應(yīng)不明顯，并且容易導(dǎo)致腸炎沙門菌產(chǎn)物丟失。所以根據(jù)分析發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR檢測保持58°C的退火溫度能達(dá)到最好的檢測效果。

根據(jù)對(duì)蠟樣芽孢桿菌、副溶血性孤菌以及腸出血性大腸埃希菌三種菌種的引物檢測為例進(jìn)行的多重PCR檢測退火實(shí)驗(yàn)得知：多重PCR檢測在退火溫度為50°C時(shí)，以上三種致病菌的特異性擴(kuò)增條帶反映效果一般，僅能體現(xiàn)很低的條帶亮度，但當(dāng)溫度到達(dá)62°C時(shí)，電泳條帶的亮度反映情況良好，便于分辨，得到的PCR檢測結(jié)果也更為確切。當(dāng)溫度到達(dá)70°C時(shí)，蠟樣芽孢桿菌引物會(huì)發(fā)生丟失，所以得出多重PCR檢測退火溫度在62°C時(shí)效果最佳的結(jié)論。

3 結(jié)語

由以上檢測結(jié)果得知，傳統(tǒng)的檢測方式對(duì)于一些特殊病菌的培養(yǎng)和檢測存在技術(shù)盲區(qū)，同時(shí)有敏感度弱、特異性低、檢驗(yàn)工作量大、檢測時(shí)間長等眾多缺陷，難以滿足對(duì)病菌食物起到檢測和預(yù)防的目的，所以具有眾多優(yōu)勢的多重PCR檢測方式亟需進(jìn)一步使用和優(yōu)化。多重PCR檢測技術(shù)首先應(yīng)用于異基因臍帶血干細(xì)胞治療假肥大型肌營養(yǎng)不良癥中。目前多重PCR診斷技術(shù)已經(jīng)普遍用于基因組結(jié)構(gòu)、基因座定位或者病源細(xì)菌檢測等多種用途中，并且通過長時(shí)間的使用，其檢測質(zhì)量也得到的肯定，尤其是能夠檢測出副溶血性孤菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌以及沙門菌方面能夠在保證檢測質(zhì)量的前提下縮短檢測耗時(shí)。

通過以上實(shí)驗(yàn)研究得知常規(guī)PCR檢測的敏感度在2×10-7ng/μL，所以高于多重PCR檢測的敏感度，對(duì)于食物中含有的病菌檢測也較為有效，但是消耗大量的試劑以及時(shí)間。多重PCR檢測與其相反，雖然靈敏度不如常規(guī)PCR檢測，但是能夠縮短檢測時(shí)間，并且能夠同時(shí)檢驗(yàn)出多種類病菌類型，所以將常規(guī)PCR檢測與多重PCR檢測相結(jié)合，取長補(bǔ)短的優(yōu)化檢測方式，建立一個(gè)具備高效、敏感、準(zhǔn)確的PCR檢測方式，能夠使6中治病的主要病菌類型在最快時(shí)間內(nèi)被全部檢測出來。

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