王艷芳，李世財，劉亞林，張 玲，李清梅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，130033；3.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，130033)

1.膠原蛋白基因的來源及結(jié)構(gòu)特征

1.1 膠原蛋白的來源

據(jù)科學研究膠原蛋白是肉食性動物特有的蛋白質(zhì)，是動物體內(nèi)含量較高的一種蛋白質(zhì)，廣泛的分布在動物的結(jié)締組織中，也是人體內(nèi)蛋白質(zhì)的重要組成部分，約占人體蛋白質(zhì)的三分之一。畜禽類動物一直是人們獲取天然膠原蛋白的主要途徑，但由于近些年各種疾病的出現(xiàn)使人們對陸生動物膠原蛋白及其制品的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑，因此人們將開發(fā)膠原蛋白的目光轉(zhuǎn)向了海洋生物。我們都知道地球百分七十是海洋，并且海洋生物資源豐富，而在許多海洋生物中各種魚類膠原蛋白含量都比較高，尤其是海洋生物加工廢棄物--皮、骨、鱗中所含有的膠原蛋白。食品科學雜志報道了一種提取牛皮中膠原蛋白的新方法--酸酶復合法,該法工藝簡單,在相對較短的制備時間內(nèi),膠原蛋白的提取率可達54.5%，在食品工業(yè)科技上報道用酶解法提取安康魚中的膠原蛋白的平均提取率達11.01%，純度可達96.5%，熱力法提取魚鱗膠原蛋白含量達45.74%，大連工業(yè)學報上記載用熱水法提取鱈魚膠原蛋白的最優(yōu)提取率可達83.75%[1]。

1.2 膠原蛋白基因的結(jié)構(gòu)

近些年隨著DNA 重組技術(shù)、DNA 探針的出現(xiàn)使人們對膠原蛋白基因有了初步研究,人們開始了探索膠原蛋白基因結(jié)構(gòu)的旅途，并獲得了一些它們在染色體上的定位資料。目前知道已有4 種膠原基因都含有一個TATA 序列,位于轉(zhuǎn)錄起始點5'端20-30b 處。E.Avvedimento,Y.Yamada 及M.Mudryj 等人對膠原蛋白基因的某些表達子的大小及一級結(jié)構(gòu)等特性進行了研究,結(jié)果表明: 表達子的大小有明顯的保守性,12 個表達子中有四個大小相同(5 4 堿基對),2 個表達子由108 個堿基對組成,恰是54 的二倍。值得指出的是, 雖然大多數(shù)表達子長度相同(54 個堿基對),但除了甘氨酸的密碼子(GGx)每隔二個三體碼出現(xiàn)一次外,表達子內(nèi)的核普酸序列不盡相同。另一個特點是, 所有的表達子的堿基對數(shù)都是9 的倍數(shù), 這是因為為保持三螺旋的連續(xù)性, 只有缺失9 個堿基對或是9 的倍數(shù)才是可行的,確實膠原蛋白分子的基本重 復單位qly - x -y 是由9 個堿基所編碼[2]。而I 型膠原蛋白的基因長約4okb，包含52個外顯子，編碼的單體肽鏈包含1464 個氨基酸殘基。單體的膠原多肽鏈由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體所合成，其前體a 鏈上含有1 個22 氨基酸殘基的信號肽序列，該信號肽序列為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號肽受體所識別，在一些移位子的幫助下可穿過ER 膜進入ER 腔中，前體鏈上的信號肽被ER 腔中的信號肽酶切割形成原膠原的單體分子結(jié)構(gòu)。原膠原分子在分泌出細胞之前，在ER中還要經(jīng)歷一系列翻譯后的修飾過程。據(jù)報道新合成的原膠原多肽鏈進入ER 腔以后至少受到9 種分子伴侶與酶的作用。多肽鏈中的脯氨酸與賴氨酸要被脯氨酸3 位羥化酶、脯氨酸4 位羥化酶及賴氨酸4 位羥化酶有選擇性地羥基化，這3 種酶都需要鐵離子、2-酮戊二酸、分子氧以及抗壞血酸作為其輔助因子。I 型原膠原蛋白分子中大約有50%的脯氨酸殘基在4 位含有1個羥基，脯氨酸的羥基化程度有種屬的差異，生活在低溫環(huán)境中的動物，其膠原蛋白上的脯氨酸羥基化程度較低，脯氨酸的羥基化對于原膠原單體之間形成氫鍵是必需的，因而對于膠原三螺旋結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性具有相當大的作用[3]。

2.膠原蛋白的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

膠原蛋白屬于細胞外基質(zhì)蛋白，呈白色，含有豐富的氨基酸--甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和谷氨酸（Glu）等18 種氨基酸，特別是甘氨酸含量最高，約占總氨基酸的27%，且每隔兩個氨基酸殘基（X，Y）即有一個甘氨酸，故其肽鏈結(jié)構(gòu)可用（Gly-X-Y）n 來表示，還含有在其它生物體內(nèi)少見的羥脯氨酸。膠原蛋白是由3 條α 鏈多肽組成,每一條鏈都是左手螺旋構(gòu)型,3 條左手螺旋鏈又相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu),即超螺旋結(jié)構(gòu)，使其蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。常見類型有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型，因其各種類型膠原蛋白具有良好的生物性能，因此在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域被廣泛的應用。

3.膠原蛋白的表達

實驗室中大腸桿菌是基因表達的重要工具，將膠原蛋白基因運用基因手段使其在大腸桿菌中表達，收獲的膠原蛋白含量可觀，并且運用大腸桿菌做宿主的遺傳背景相對比較清楚，表達易于控制，且大腸桿菌易于培養(yǎng)，可以獲得較高產(chǎn)量的膠原蛋白[4]。早在1980 年，Uit toJ 等就從人的皮膚細胞體外培養(yǎng)中獲得到了Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白。1997 年，在芬蘭Oulu 大學膠原蛋白研究中心在研究人的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原蛋白全序列的畢赤酵母表達中取得較大的成功。經(jīng)過大量研究表明了膠原蛋白與脯氨酸羥化酶在宿主細胞的共表達是一個很好的策略。1999 年BruinEC 等人使用漢森酵母和畢赤酵母作為宿主，表達人類Ⅰ型膠原蛋白的肽鏈，并做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)使用膠原蛋白自身的信號肽能使?jié)h森酵母表達并分泌重組蛋白，卻不能使畢赤酵母分泌重組膠原蛋白。NokelainenM 等人使用兩種桿狀病毒轉(zhuǎn)染的昆蟲細胞生產(chǎn)類人特異性軟骨膠原Ⅱ型，表達出具有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)的蛋白,產(chǎn)量達到50mg/mL。通過DD-PCR 得到人I 型膠原蛋白基因。該基因的讀碼框長4395bp,編碼1464 個氨基酸,編碼蛋白分子量約139.01kD。該基因在胃癌及食管癌組織中的表達量高于其對應的癌旁組織,并且在食管癌組織中的表達差異較胃癌中更明顯。人I 型膠原蛋白基因在胃癌及食管癌中均呈高表達,推測其可能在胃癌及食管癌的發(fā)生發(fā)展中起作用[5]。

4.膠原蛋白的相關(guān)產(chǎn)品及應用

隨著人們對膠原蛋白需求量的逐漸增多，提取膠原蛋白的方式已經(jīng)不能滿足日益增長的膠原蛋白市場的需求，于是新的生產(chǎn)膠原蛋白的方法-生物反應器，不僅滿足了人們對膠原蛋白量的需求而且更加安全可靠，從而使膠原蛋白在各個領(lǐng)域得到了廣泛的應用。

4.1 食品產(chǎn)業(yè)

民以食為天，我們就先來探討一下膠原蛋白在食品領(lǐng)域的重要應用。膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),其分子在細胞外基質(zhì)中聚集為超分子結(jié)構(gòu)。含有人體內(nèi)重要的必需氨基酸和非必需氨基酸如甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸等，因此對人體有重要的作用。

4.1.1 肉制品和肉制品的包裝材料

膠原蛋白的水解產(chǎn)物-明膠，通過破壞膠原蛋白分子間的氫鍵，使其原有的超螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，形成結(jié)構(gòu)較為松散的小分子。加入肉制品中可以改善結(jié)締組織的嫩度，使其具有良好的品質(zhì),增加蛋白質(zhì)的含量。并且添加在肉質(zhì)食品中色澤鮮艷，易于被消費者所接受。因其具有緊密的螺旋結(jié)構(gòu)，從而顯示出很強的韌性和強度，氨基酸組成又使其具有優(yōu)良的成膜能力。這些有利條件促成了其在食品包裝材料中的應用?？芍瞥傻娜忸?、魚類的包裝紙、涂抹層及可食包裝膜，具有良好的抗拉強度、熱封性、阻氣、阻油、阻濕性，可防止食品吸潮或干縮變形[6-7]。

4.1.2 冷凍食品

小孩經(jīng)常吃的果凍、雪糕、冰激凌等食品中即是以膠原蛋白為膠凍劑，具有熔點低、入口即化的特點，因此可做為冷凍食品的改良劑，避免食品氧化、抑制褐變反應。

4.1.3 飲料、酒類食品

據(jù)有關(guān)文獻報道飲料、酒類食品的澄清劑，大多是膠原蛋白制成的，在發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中應用尤為廣泛，特別是作為發(fā)酵后期除去酒中的一些膠體懸浮物的最佳澄清劑。魚膠是國際上公認的高級澄清劑, 在啤酒和葡萄酒行業(yè)中取得十分好的效果，產(chǎn)品質(zhì)量也非常穩(wěn)定。在果酒釀造過程中也起到增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、澄清劑等作用。在茶飲料的生產(chǎn)中，明膠又可防止茶飲料長期存放引起的混濁，改善茶飲料品質(zhì)的目的。

4.1.4 保健食品

膠原蛋白能夠為人體膠原蛋白的合成提供優(yōu)質(zhì)的氨基酸原料，尤其是脯氨酸和羥脯氨酸，促進膠原蛋白的合成，及時補充人體皮膚流失的膠原蛋白，有助于維持皮膚中膠原蛋白的特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而達到改善皮膚水分，延緩皮膚衰老的作用。目前，以膠原蛋白為主要原料開發(fā)的保健食品日益受到廣泛的認可，更高層次的符合了現(xiàn)代人“從內(nèi)到外”對美麗的追求[8]。

5.2 化妝品上的應用

膠原蛋白作為一種新型的化妝品原料，對人體皮膚和毛發(fā)均有較好護理效果。許多高檔化妝品中都添加有膠原蛋白，它為皮膚提供必需的營養(yǎng)成分，補充多種氨基酸，加強了皮膚的活性，保持角質(zhì)層水分以及纖維結(jié)構(gòu)的完整性，改善皮膚細胞生存環(huán)境和促進皮膚組織的新陳代謝。市面上含膠原蛋白的化妝品品牌Col ly Pink、派高、HR 眼霜和面霜、SISLEY 膠原蛋白霜、DR.CILABO 海洋膠原蛋白霜、HR 赫蓮娜膠原蛋白、活膚乳液Avon、雅芳青春養(yǎng)顏潔面乳、Avon 雅芳青春養(yǎng)顏除皺精華、貝健魚蛋白片、全金膠原蛋白粉、建泰爾膠原蛋白等。由于膠原及其水解物與人皮膚膠原的結(jié)構(gòu)相似，相容性好，可以擴散到皮膚的深層，對人的皮膚有很好的營養(yǎng)作用，且膠原蛋白分子外側(cè)存在大量的羧基和羥基，同時存在大量的甘氨酸等天然保濕因子，能提高組織細胞的貯水能力，使皮膚保濕；許多種膠原蛋白多肽與皮膚細胞的生長、分化、分裂、增殖有關(guān)，能提供皮膚的養(yǎng)分，延緩皮膚衰老，促進皮膚創(chuàng)面修復；膠原蛋白溶液還有很強的抗輻射作用，因而廣泛應用于化妝品行業(yè)[9-11]。

4.3 生物醫(yī)學材料

近些年膠原蛋白廣泛的應用到生物醫(yī)學材料中，用膠原蛋白制成的膠原蛋白海綿、絲線和薄膜，主要用于外科止血，在皮膚醫(yī)學上膠原蛋白制成的傷口敷料和人工皮膚用于傷口愈合，血管和心瓣膜用于心臟外科手術(shù)，膠原蛋白膜用于口腔外科、促進牙周鍵膜再生和口腔吸收性覆料，藥物投遞輔助機制用于生長素、生化大分子和質(zhì)體基因投遞工具;膠原蛋白基質(zhì)膜板用于植入細胞作為組織、器官再生的模板。

4.4 制藥領(lǐng)域

屬于藥物輸送系的干擾素緩釋藥劑和性器官疵癥治療緩釋劑，風濕性關(guān)節(jié)炎治療用藥、轉(zhuǎn)基因動物由乳中生產(chǎn)人類膠原蛋白用以調(diào)制藥劑，膠原蛋白發(fā)酵制成的降血壓劑；組織工程用膠原蛋白制成人工皮膚、人工食道、人工器官、燒傷保護膜等；人工骨即在骨生長因子中混合膠原蛋白膜、組織與骨修復用膠原蛋白和骨骼修復劑；膠原蛋白藥劑也可制成膀胱失禁用藥；美容外科用膠原蛋白整形。

5.膠原蛋白的發(fā)展前景

膠原蛋白作為一種天然的生物資源，具有高分子材料無法比擬的生物相容性和可降解性，廣泛的應用在食品、醫(yī)學、保健和化妝品等領(lǐng)域中。隨著我國科技進步、經(jīng)濟發(fā)展及人民生活水平的提高，對于外在美和內(nèi)在美越來越重視，人們將焦點聚集到了膠原蛋白上。對膠原蛋白及其制品的深入研究和生產(chǎn)工藝的不斷改進, 越來越多膠原蛋白產(chǎn)品將滿足人們的不同需求, 特別是用在生物醫(yī)學領(lǐng)域的膠原蛋白制品將會不斷出現(xiàn)。膠原蛋白將會更廣泛地造福人類，成為人們?nèi)粘Ｉ畈豢苫蛉钡囊徊糠帧?/p>

6.膠原蛋白目前在表達和應用上存在的問題

隨著膠原研究領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多不同類型的膠原。這些膠原蛋白都有獨特且重要的生物功能，為人類提供重要各種產(chǎn)品，同時由于不同膠原蛋白基因的突變也引起了的人類疾病的劇增。盡管研究工作已經(jīng)有了很大的進展，但許多問題，如除常見的幾種膠原蛋白外其他類型膠原的結(jié)構(gòu)和功能、控序列，明膠結(jié)構(gòu)的基本特性和膠原-明膠的轉(zhuǎn)化，膠原蛋白的調(diào)控序列具體過程等目前還無法回答。

6.1 表達上的問題

膠原蛋白基因的表達是其本身的順式作用元件、反式作用元件以及諸多調(diào)控因子相互作用的結(jié)果。并且?guī)讉€膠原蛋白的第一個內(nèi)含子都含有調(diào)控序列。膠原蛋白基因的表達是其本身的順式作用元件、反式作用因子以及諸多調(diào)控因子相互作用約結(jié)果。在眾多的調(diào)控因子中,ILJ、TGF-β、肝纖維化因子等屬于正調(diào)節(jié)因子，能夠刺激膠原基因的轉(zhuǎn)錄；而γ-INF、PGE2 固醇類激素等屬于負調(diào)節(jié)因子，在一定程度上抑制了膠原基因的轉(zhuǎn)錄；但對于膠原蛋白的各個轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控因子的作用機制及其轉(zhuǎn)錄機制和速度等問題有待進一步研究[12]。對I 型膠原蛋白基因的功能、I 型膠原蛋白基因在其他惡性腫瘤中是否也高表達以及在胃癌及食管癌中具體通過何種途徑發(fā)揮促癌作用等方面進行的深入研究,將會有利于解析腫瘤形成、發(fā)展的機制，從而從根本上解決癌癥問題。

6.2 應用上的問題

膠原蛋白其實就是一種蛋白質(zhì)，被分解為氨基酸后，其膠原蛋白的形態(tài)和結(jié)構(gòu)已不復存在，也不可能直接以膠原蛋白的形式補充到皮膚中，因此開發(fā)一種承載膠原蛋白的載體已成為研究膠原蛋白藥物應用的當務之急。由于膠原蛋白熱使有些廠家在膠原蛋白類食品、化妝品、藥物方面大做文章，對消費者造成一定影響，再加在利潤的誘惑下使有些商家在提取膠原蛋白工藝上偷工減料，使其產(chǎn)生一些有害的物質(zhì)，對人們身體健康造成了很大的影響。因此對膠原蛋白知識的普及應該得到重視[13]。

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